三聚氰胺的前處理？

laisheng

有人知道檢測三聚氰胺的方法嗎？還有前處理是怎樣操作的？我這里有個“三聚氰胺定量檢測試劑盒    Cat.# 20-0158”使用說明書。。適用Beacon三聚氰胺檢測試劑盒是利用酶聯(lián)免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。請問一下：用這個方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度到底為多少？

nety

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這里找找有檢測方法的！2007年的帖子有拉！

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HPLC保留時間漂移的故障排除

保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：即保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動相所致）等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下:

一 色譜柱平衡
    如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。
    流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。

二 固定相穩(wěn)定性
    固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。
    經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。

三 色譜柱污染
    保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。
樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。如：配藥中的賦形劑，生化樣品（如血清）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加。可以通過使用固相提?。⊿PE）等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。
    避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。
    使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

四 流動相組成
    流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。

五 疏水坍塌
    當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡。由是色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱或非端基封口的色譜柱也可避免發(fā)生坍塌。

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工業(yè)上測定三聚氰胺的純度通常采用苦味酸法和升華法?？辔端岱ǚ椒ㄔ? 將水加入試樣, 加熱溶解后, 加人苦味酸溶液, 稱量所生成的苦味酸三聚氰胺沉淀的質(zhì)量, 即測得三聚氰胺純度含量。分析步驟: 稱取試樣, 置于500 ml 錐形瓶中, 同時加入水, 加熱溶解; 冷卻后, 加入酚酞指示液3 滴, 若顯色, 加入硫酸溶液, 直至溶液顏色消失, 若有不溶物, 需過濾, 水洗; 把濾液和洗液合并, 移人500 ml 容量瓶中, 加水至刻度, 仔細(xì)振搖混合后, 準(zhǔn)確吸取100 ml 置于500 ml 燒杯里; 將此溶液加熱至80℃, 另加入已加熱至80℃的100 ml 苦味酸溶液, 冷卻至室溫后, 保持在15℃以下約8 小時; 用已恒重的玻砂過濾器過濾, 之后,先用約100 ml 苦味酸三聚氰胺的飽和溶液洗滌, 再用水洗; 烘干玻砂過濾器, 置于干燥器中冷卻后, 稱量求得沉淀物質(zhì)量。升華法測定原理: 在升華裝置中將試樣在負(fù)壓下進(jìn)行加熱, 讓三聚氰胺完全升華后, 稱其殘渣量, 即測得三聚氰胺純度。分析步驟: 稱取試樣, 置于預(yù)先干燥了的且已知質(zhì)量的試樣容器里; 將試樣容器置入減壓升華裝置內(nèi),待完全密閉后, 開啟真空裝置緩緩吸引, 并調(diào)節(jié)裝置內(nèi)的溫度, 經(jīng)2 小時升華結(jié)束; 取出試樣容器, 冷至室溫后, 稱量試樣容器的質(zhì)量。上述兩種測定方法準(zhǔn)確度均較高, 但操作繁瑣, 分析時間太長,有人推薦采用電位滴定法。具體測定方法, 首先測定三聚氰胺溶液中總固體的含量, 稱取樣品于200 ml燒杯中, 加入100 ml 蒸餾水, 放于石棉網(wǎng)的電爐上加熱,在沸騰的情況下攪拌溶液, 使試樣完全溶解。在電磁攪拌狀態(tài)下, 用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定熱溶液至pH 值為5 左右。流水冷卻溶液至室溫, 滴定, 每次準(zhǔn)確加入0.1 ml 硫酸標(biāo)液,并記下相應(yīng)的pH 值, 直至pH 值約為3。計算出等當(dāng)量點(diǎn)時消耗硫酸標(biāo)液的體積。結(jié)果計算按公式Me=S×6.307×V×F /m ( 其中式中:Me 為溶液中三聚氰胺的含量, %; S 為溶液中總固體的含量, %; V 為等當(dāng)量點(diǎn)時消耗硫酸標(biāo)液的體積, ml; F 為0.5 mol /L 硫酸標(biāo)液的校正系數(shù); m 為滴定時所標(biāo)取總固體的質(zhì)量; 6.307 為換算系數(shù)) 。
三聚氰胺的樣品前處理及最新LC-MS檢測方法：ASB親水色譜柱
1 前言
三聚氰胺(melamine)簡稱三胺, 學(xué)名三氨三嗪, 別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 。分子量：126.12，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料〔2〕。三聚氰胺顯弱堿性，能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚氰胺鹽。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解，胺基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物。三聚氰胺與醛反應(yīng)制成樹脂，三聚氰胺樹脂是一種多種用途的材料，防火耐熱且有很高的穩(wěn)定性，用于生產(chǎn)塑料、廚房用具、防火纖維、商業(yè)濾膜、膠水和阻燃劑，部分亞洲國家，也被用來制造化肥。
2 材料與試劑
2.1 儀器與條件
Agilent 1100高效液相色譜儀（美國，Agilent公司）；二極管陣列檢測器（DAD），檢測波長240nm，柱溫：40℃。
（1）Agela VenusilTM ASB C18（ 4.6×250mm）；緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉； 流動相：緩沖溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min。
（2）Agela VenusilTM ASB C8（ 4.6×250mm）；流動相：緩沖液：乙腈=85：15；緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0；流速：1.0mL/min；
離子交換固相萃取柱Agela ClearnertTM PCX(北京艾杰爾科技有限公司)
2.2 試劑與樣品
寵物飼料樣品（農(nóng)業(yè)部飼料供應(yīng)中心提供）；甲醇、乙腈為北京艾杰爾科技有限公司提供；氨水、乙酸鉛、三氯乙酸、均購于北京化學(xué)試劑公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸、辛烷磺酸鈉（Sigma公司）；甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。
3 實驗方法
3.1樣品前處理方法
(1) 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制：
取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時，以提取液(0.1%三氯乙酸)稀釋至所要的濃度。
(2) 提取：
稱取飼料樣品5g，加入50ml 0.1%三氯乙酸提取液，充分混勻，加入2mL 2%乙酸鉛溶液，超聲20min。然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，8000rpm/min離心10min，取上清液3mL過混合型陽離子交換小柱(PCX)。
(3) 凈化(PCX小柱，60mg/3mL) ：
a) 活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
b) 上樣：加入提取液3mL
c) 淋洗：3mL水；3mL 甲醇；棄去淋洗液并將小柱抽干。
d) 洗脫：5mL 5%氨化甲醇(v/v)洗脫。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
e) 濃縮：50℃，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。
3.2 HPLC檢測方法
3.2.1 三聚氰胺HPLC-UV檢測方法
三聚氰胺是強(qiáng)極性化合物，在傳統(tǒng)的反相C18柱上保留很差，需要用離子對試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的三聚氰胺檢測方法和中國農(nóng)業(yè)部公布的三聚氰胺檢測方法，采用艾杰爾(Agela) ASB系列親水色譜柱，可以得到良好的分離效果，分析色譜圖如下：
圖2 Venusil ASB 色譜柱分離三聚氰胺的譜圖
(a) 色譜柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm；標(biāo)準(zhǔn)：FDA方法；流動相：緩沖液：乙腈=85：15；緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0；流速：1.0mL/min；柱溫：40 oC；波長：240nm
(b) 色譜柱：Venusil ASB-C18 4.6×250mm；標(biāo)準(zhǔn)：中國農(nóng)業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)方法；緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉； 流動相：緩沖溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min;柱溫：40℃；波長：240nm
空白加水平（mg/L） 回收率
0.01 116%
0.1 108%
0.5 92%
2 96%
由上表1可以看出：用PCX柱凈化樣品，可以得到滿意的回收率，此方法處理樣品，比FDA公布的前處理方法更加準(zhǔn)確、可靠。
3.2.2 三聚氰胺LC-MS檢測方法
由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流動相添加了離子對試劑，因此限制了液質(zhì)聯(lián)用方法的使用；但不用離子對試劑色譜方法，三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，不能得到較好的分離定量〔3〕。
基于此問題，艾杰爾科技公司自主開發(fā)了新的方法，采用艾杰爾(Agela) ASB系列親水色譜柱，不用離子對試劑也能得到有效的保留與分離。因此方法中流動相不含離子對試劑，可以用于質(zhì)譜檢測。
與FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation (HPLC-UV)》相比較，該方法大大降低了最低檢測限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm），提高了檢測靈敏度。
以該方法分別在ASB-C8 4.6×250mm 　ASB-C18 4.6×250mm 得到的譜圖如下：
圖3 LC-MS方法檢測三聚氰胺的譜圖
緩沖液：10mM的NH4AC；流動相：Buffer:：ACN=95：5；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：樣品先用70%ACN溶解成約1mg/mL，用ACN稀釋成0.1mg/mL，進(jìn)10uL；柱溫：40℃；波長：240nm
4 結(jié)果與討論
4.1陽離子交換柱(PCX)
三聚氰胺呈弱堿性(弱陽離子化合物)，凈化過程一般應(yīng)選擇陽離子交換柱。混合型的陽離子交換柱(PCX)通過將磺酸基團(tuán)(-SO3H)鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機(jī)理，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：
a) 可通過兩種不同溶液的洗滌(水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑)，使樣品更干凈，提高檢測的靈敏度。
b) 批次重復(fù)性好。
c) 回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。
4.2 LC-MS方法優(yōu)點(diǎn)：
（1）檢測過程簡便：無須添加離子對試劑，三聚氰胺就可得到良好的保留與分離，避免了配制離子對流動相的復(fù)雜過程。
（2）提高了檢測的靈敏度：無離子對試劑，可以用于質(zhì)譜檢測器，大大降低了最低檢測限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm）。
（3）降低了檢測成本：不用離子對試劑，就不再需要買價格較貴的離子對試劑了，從而降低了檢測成本。
（4）延長了色譜柱的使用壽命：避免了使用離子對試劑減少色譜柱壽命的影響。
（5）該方法所使用的色譜柱具有通用性：無論是用FDA方法、中國農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)方法和本公司開發(fā)的LC-MS方法，使用艾杰爾(Agela) ASB系列親水色譜柱均能得到一個很好的檢測結(jié)果，從而給客戶提供了多種選擇空間。

lxd9580

很全面啊，這個東西害人不淺