尿素酶快速測定方法之比較

李芝銀

隨著膨化技術(shù)在飼料工業(yè)中推廣普及，越來越多的飼料生產(chǎn)商在配方中使用膨化大豆粉，與其它蛋白資源一樣，大豆的適度熟化非常重要，熟化程度低會(huì)含抗胰蛋白酶等營養(yǎng)抑制因子，熟化度過高又會(huì)導(dǎo)致氨基酸利用率低。判斷膨化大豆粉是否合格的主要指標(biāo)是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的條件下，每分鐘每克膨化大豆分解尿素所釋放的氨態(tài)氮的毫克數(shù)。脲酶本身無營養(yǎng)意義，但它與抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇熱變性失活的程度與抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用來作為膨化大豆加熱是否合適的間接估測指標(biāo)。脲酶活性沒有負(fù)值，最低為0。在我國現(xiàn)行的國標(biāo)推薦值為0.3，在美國一般認(rèn)為以不超過0.2為宜，并且針對日糧中有尿素的反芻動(dòng)物而言不得超過0.12，當(dāng)然對于家禽和豬0.3或稍高都可以接受。國內(nèi)很多大企業(yè)一般均采用0.2。 實(shí)驗(yàn)室定量測定脲酶活性的方法較復(fù)雜，有滴定法和pH增值法兩種，已有研究表明兩者對同一樣品測得的數(shù)值也不相等。目前國內(nèi)絕大部分企業(yè)都采用快速而簡單的簡易判定方法定性地估測脲酶活性，一般來說，主要有如下兩種方法。
一.液態(tài)法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，會(huì)使酚紅指示劑改變顏色。
2.試劑
2.1尿素:GB696，分析純。
2.2酚紅指示劑
2.2.1稱取0.1g酚紅，加1.43mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在研缽中研磨以促溶解；
2.2.2轉(zhuǎn)移至250mL定量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻備用。
3.操作方法
3.1取0.2g粉末樣品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚紅指示劑2滴，再加水20mL，充分搖勻15s。
3.3記錄粉紅色出現(xiàn)時(shí)間，并根據(jù)時(shí)間判斷尿酶活性，顏色出現(xiàn)時(shí)間應(yīng)少于15min。
顏色出現(xiàn)時(shí)間

脲酶活性
1min             極強(qiáng)
1～5min
強(qiáng)
5～15min
稍有
15min             無
同時(shí)作空白對照試驗(yàn)。
樣品空白(不加尿素)及試劑空白(不加樣品)，只有上述空白正常時(shí)，即酚紅指示劑不改變顏色，試驗(yàn)結(jié)果才是可靠的。
一般企業(yè)認(rèn)為7、8分鐘變色較為合適。

二、半固態(tài)法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，會(huì)使酚紅指示劑改變顏色。
2.試劑
2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。
2.2尿素一酚紅試劑
2.2.1將1.2克酚紅溶解于30ml0.2N的NaOH中；
2.2.2用蒸餾水將之稀釋至約300mL；
2.2.3加入90g尿素（分析純）并溶解之；
2.2.4用蒸餾水稀釋至2L；
2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；
2.2.6用蒸餾水稀釋至最后體積3L；
2.2.7溶液應(yīng)具明亮的琥珀色。
3.操作方法
3.1在一個(gè)150ml的燒杯中倒入少量試劑，注意溶液必須呈明亮的琥珀色。若溶液已轉(zhuǎn)變?yōu)樯罱奂t色，滴人稀硫酸溶液并攪拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2量一匙粉末樣品，放置于培養(yǎng)皿中。
3.在樣品上加入兩匙試劑，輕輕攪拌，將樣品平鋪于培養(yǎng)皿中。若仍有干樣品斑點(diǎn)，則再加入試劑，直至將樣品浸濕。
4.放置5分鐘后觀察：
a.       沒有任何紅點(diǎn)出現(xiàn)：再任其放置25分鐘，若仍無紅點(diǎn)出現(xiàn)，說明大豆粉過熟。
b.      有少量紅點(diǎn)：少量尿素酶活性，可用。
c.       樣品表面約有25％為紅點(diǎn)覆蓋：少量尿素酶活性，可用。
d.      豆餅表面約有50％為紅點(diǎn)覆蓋：尿素酶活性較高，不可以使用。
e.       豆餅表面的75％－100％為紅點(diǎn)覆蓋：尿素酶活性很高，樣品過生，不能使用。
以上兩種簡易脲酶活性估測方法在國內(nèi)各飼料廠被廣泛采用，尤其是后者在膨化大豆粉生產(chǎn)的在線檢測上很普遍。盡管這兩種方法原理一樣，但是，因其操作過程差異，所以對膨化大豆粉品質(zhì)的反映內(nèi)容也不盡相同。
三、液態(tài)法和半固態(tài)法之比較
首先需要說明的是，這兩種脲酶活性快速檢測方法沒有行業(yè)約定俗成的名稱，筆者接觸過的企業(yè)均只采用其中的一種方法，對前者可以稱之為“試管法”，后者稱之為“表面皿法”，根據(jù)其實(shí)施的過程及樣品的狀態(tài)，筆者將其區(qū)分為“液態(tài)法”和“半固態(tài)法”。
從實(shí)施方法來看，液態(tài)法是過程檢測，從開始一直到規(guī)定時(shí)間段結(jié)束，而半固態(tài)法屬于斷點(diǎn)檢測，是5分鐘后看結(jié)果；液態(tài)法通過控制各個(gè)體合格，總體自然合格，而半固態(tài)法要求的是總體符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格，即允許部分個(gè)體不合格。簡單地說，液態(tài)法要求每一個(gè)微粒的熟化程度均要滿足5分鐘以內(nèi)不變色，如果一個(gè)不合格，整個(gè)批次為不合格；而半固態(tài)法允許部分微粒在5分鐘內(nèi)變色，部分不合格，總體可以是合格的。從這點(diǎn)上來說，液態(tài)法對膨化大豆粉的品質(zhì)要求更高，控制更嚴(yán)格，不僅要求熟化，而且要均勻熟化。舉例說明，如果在熟化完全的大豆粉樣品中摻入微量（可以是一粒）生大豆粉，液態(tài)法會(huì)立即變色從而判定為不合格，而半固態(tài)法只是增加了一個(gè)變色點(diǎn)，總體上仍是合格的。
從上可以看出，這兩種檢測方法對膨化大豆粉品質(zhì)的反映內(nèi)容是不一樣的。半固態(tài)法反映的是產(chǎn)品符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格，而液態(tài)法反映的是完全合格。這兩種不同檢測方法對膨化設(shè)備的要求也是有差別的，液態(tài)法要求設(shè)備能均勻熟化，而半固態(tài)法允許產(chǎn)品出現(xiàn)部分不合格，只要總體上符合就可以，對膨化設(shè)備的要求自然要低。
可能會(huì)有人疑問，膨化大豆粉出來的不都應(yīng)該是均勻一致的嗎？其實(shí)不然，物料在膨化機(jī)內(nèi)受到濕、熱、機(jī)械剪切的共同作用從而熟化，機(jī)械剪切對膨化大豆粉所起的作用大約能占三成多，如果結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上缺陷或部件磨損，就會(huì)導(dǎo)致熟化不均勻。目前濕法膨化大豆粉的出料溫度大都在135度左右（對家禽和豬要求可能低點(diǎn)），六年前，筆者曾遇到過膨化大豆粉出料溫度在170度，用液態(tài)法檢測仍不合格，出來的料有熟的，有褐變的，還有少許夾生的，如果用半固態(tài)法檢測，估計(jì)就合格了。次年，一膨化廠使用某企業(yè)膨化機(jī)生產(chǎn)膨化大豆粉，因不熟被退貨六十噸，根據(jù)大部分企業(yè)采用半固態(tài)法檢測的情況，將其以一定比例摻入熟化料中，最終符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格。上述事件，大概就是這兩種不同測定方法的實(shí)踐意義吧。

北京現(xiàn)代洋工機(jī)械科技發(fā)展有限公司 李芝銀

complement

請問膨化大豆粉的脲酶活性指標(biāo)控制在多少合適？

李芝銀

看來沒仔細(xì)看啊 呵呵
在我國現(xiàn)行的國標(biāo)推薦值為0.3，在美國一般認(rèn)為以不超過0.2為宜，并且針對日糧中有尿素的反芻動(dòng)物而言不得超過0.12，當(dāng)然對于家禽和豬0.3或稍高都可以接受。國內(nèi)很多大企業(yè)一般均采用0.2。正大系統(tǒng)一般為0.02~0.05。尿素酶活性不是越低越好，太低，會(huì)影響蛋白消化吸收率。因此，一些大集團(tuán)也同時(shí)測定蛋白溶解度，一般在0.75~0.8之間。
前些日子參加膨化機(jī)國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)審，其中對膨化大豆粉的脲酶活性以0.2計(jì)。

complement

對，正大系統(tǒng)的要低一些，我們的標(biāo)準(zhǔn)和它差不多。

春節(jié)

"滴人稀硫酸溶液并攪拌之，直至溶液再度呈琥珀色。"請問如果操作失當(dāng)，多滴了一兩滴稀硫酸，會(huì)不會(huì)影響測定結(jié)果？

vicar

說的很透徹啊

蘇曉

向李芝銀同志致敬，我這段時(shí)間從他的共享中在膨化方面受到很大幫助。