對(duì)溶菌酶的工藝開發(fā)角度的綜述

葉赫娜蘭.孤城

王兄：

　　你好！

　　來信收到，你的報(bào)告很直接，也很簡(jiǎn)潔，相信是企業(yè)所樂于接受的。你說的可行性報(bào)告，我稍后會(huì)一一做來，或者，王兄你做，是不是更直接，不管怎樣，我先把溶菌酶及其他結(jié)構(gòu)活性物質(zhì)（主要是蛋白）在畜牧行業(yè)的應(yīng)用，簡(jiǎn)單介紹下。

獸用結(jié)構(gòu)蛋白，在分子時(shí)代以前，主要是以下幾個(gè)方面：

1、蛋白提取溶菌酶，主要用于很特殊的方面，如，極端抗藥性的感染情況下，奶牛子宮消炎等，原因是價(jià)格，換算成純蛋白，成本在2000-3000元/KG，用這種工藝得到的溶菌酶是不具備大量應(yīng)用的可能的（大量應(yīng)用的價(jià)格應(yīng)在1000以內(nèi)）。

2、蛋黃抗體，當(dāng)惡性獸類流行病橫行時(shí)，會(huì)先讓雞輕微感染此病，然后在蛋黃內(nèi)提取抗體，缺點(diǎn)還是成本，奇高。

3、免疫激活劑，主要是微生物細(xì)胞壁上附著的糖蛋白，是細(xì)胞壁的粗制品，低端產(chǎn)品，效果不穩(wěn)定，不明確。

4、偽干擾素類產(chǎn)品，由免疫激活劑加載植物提取物，抗病毒合成藥物而成，低端產(chǎn)品，有效果，但事實(shí)是草藥和抗病毒藥物的效果，這類產(chǎn)品，簡(jiǎn)直是他媽兒戲。

5、干擾素，理論上講，可以從血液得到動(dòng)物干擾素，但干擾素有種的差異性，所以，從成本上考慮，不可能把動(dòng)物源干擾素用于同種動(dòng)物。所以，實(shí)際上，這種產(chǎn)品，是沒有的。

葉赫娜蘭.孤城

　　在分子時(shí)代前，得到蛋白藥物也是不難的，如溶菌酶，抗體，干擾素，但成本是不能接受的，只有進(jìn)入分子時(shí)代后，用分子技術(shù)生產(chǎn)蛋白，才具有真正意義上的商業(yè)價(jià)值。

　　發(fā)酵行業(yè)進(jìn)入分子時(shí)代后，畜牧業(yè)也正好面臨一個(gè)大的變動(dòng)，就是歐盟的全面禁抗（抗生素），大陸的畜牧業(yè)，不具備依靠國內(nèi)市場(chǎng)存活的能力，而大陸的養(yǎng)殖環(huán)境，又決定了養(yǎng)殖動(dòng)物始終是在亞健康狀態(tài)生長(zhǎng)，這就進(jìn)入了一個(gè)悖論：誰用抗生素，誰的產(chǎn)肉率高，而誰的產(chǎn)品就沒法賣；誰不用抗生素，誰的產(chǎn)肉率就低，誰就賠錢賣！分子時(shí)代的溶菌酶，就是在這種環(huán)境下，被提上了議事日程。

　　為什么首先是溶菌酶，而不是其他產(chǎn)品，如干擾素，如抗體，被關(guān)注呢？不同于溶菌酶，做抗體，做干擾素，一方面，聽起來技術(shù)含量就高（注意，是聽起來，聽起來而已），而且，在人藥方面，抗體和干擾素積累了大量的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，比如說，高等動(dòng)物基因在微生物細(xì)胞環(huán)境內(nèi)表達(dá)，比如說，糖基化（沒有糖基化的蛋白會(huì)被蛋白酶水解，而來不及表達(dá)活性）及高等動(dòng)物糖基化的種的差異性，這些經(jīng)驗(yàn)完全可以在開發(fā)雞，牛，豬，馬，鴕鳥，駱駝，老虎，等等而應(yīng)用。

葉赫娜蘭.孤城

　　其實(shí)，這牽扯到畜牧業(yè)的行業(yè)特點(diǎn)，駱駝，老虎不是不能養(yǎng)，是量太少，而雞，牛，豬，我們關(guān)心的是在群體水平下，在可接受的經(jīng)濟(jì)投入上，動(dòng)物產(chǎn)品的最大化，雖然，個(gè)體死亡是構(gòu)成群體死亡的元素，是行業(yè)不愿看到的，但，事實(shí)上，個(gè)體死亡是不被嚴(yán)肅對(duì)待的，更絕對(duì)不會(huì)真正注意個(gè)體水平的健康問題。換句話說，畜牧業(yè)關(guān)心的是，以經(jīng)濟(jì)投入為x軸，以動(dòng)物蛋白產(chǎn)量為y軸，得到函數(shù)的微分函數(shù)的最大值。

　　所以，只有具有以下特點(diǎn)的產(chǎn)品才有可能在這個(gè)行業(yè)里，（這種游戲規(guī)則下）被重視（或說，也會(huì)很快實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品附加值）：

1、價(jià)格低，（當(dāng)然，附加值更低）用量大，可以被大量應(yīng)用，最好是防病或用于亞健康，如果治療，應(yīng)用面就窄了（這個(gè)行業(yè)的市場(chǎng)容量之大，始終會(huì)超出人的想象，在行業(yè)待了4年，聽了不少傳聞，看了不少傳奇，當(dāng)聽到哪個(gè)產(chǎn)品賣了多少，有時(shí)我還會(huì)吃驚，更不是業(yè)外人士可以想見）。
   
2、可以適用于應(yīng)付群體生長(zhǎng)問題，令用戶在此水平核算成本與收益，而不是面對(duì)動(dòng)物個(gè)體的問題。

3、開發(fā)商，如有遠(yuǎn)見，把產(chǎn)品開發(fā)，定位時(shí)，充分考慮和接受以上兩點(diǎn)，而生產(chǎn)的產(chǎn)品。

葉赫娜蘭.孤城

那么，我們看一下，就會(huì)發(fā)現(xiàn)溶菌酶可以在現(xiàn)在的歷史條件下（歐盟的全面禁抗，及相應(yīng)的國內(nèi)國際背景），經(jīng)過努力，是可以符合以上1，2，3，點(diǎn)了。因此，首先被關(guān)注的，是它（而抗體和干擾素，只能作為第二代產(chǎn)品應(yīng)用----除非突然出現(xiàn)某種對(duì)癥的惡性流行病，才能打破這個(gè)次序）。

現(xiàn)在的歷史時(shí)期，是其他科研單位，包括我們實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)典做抗體和干擾素，面對(duì)開發(fā)，首先想到人用藥模式（生產(chǎn)規(guī)模，利潤(rùn)率，利潤(rùn)、成本構(gòu)成，利潤(rùn)模式，市場(chǎng)模式），用它來衡量獸用溶菌酶開發(fā)，如果看不到市場(chǎng)真正的大小，即便不考慮轉(zhuǎn)讓費(fèi)，就算只是“為做好一件事，而去做這件事”也是很容易打退堂鼓的，因?yàn)樵谌擞盟幍乃悸废拢?0升微型罐，精提取，精包裝，代金銷售，高回扣），獸用藥給出的價(jià)格，是不可想象的。

所以，目前暫沒有國內(nèi)權(quán)威研究機(jī)構(gòu)做這一塊工作，不過，既然已經(jīng)進(jìn)入了分子時(shí)代，而且，分子改造生產(chǎn)的確成本大大低于蛋清提取，行業(yè)內(nèi)還是有做的。下面對(duì)此進(jìn)行介紹。

葉赫娜蘭.孤城

澳洲易太公司，是名義上的海外公司，經(jīng)濟(jì)內(nèi)幕不詳。人員構(gòu)成，以畜牧業(yè)海歸為主?？谔?hào)類似湖南衛(wèi)視，說：“我們一直被模仿，但從未被超越。”這樣類似的話。據(jù)說是國內(nèi)最大的獸用溶菌酶生產(chǎn)廠家，應(yīng)用技術(shù)不詳。但從成本考慮，肯定不是蛋清提取。懷疑是酵母菌表達(dá)。

杭州康德權(quán)公司，申請(qǐng)有一個(gè)專利，但似乎始終沒有產(chǎn)品問世，專利顯示，是用酵母菌表達(dá)（我甚至懷疑他們并沒有工業(yè)水平的技術(shù)，而搖瓶又太沒意義）。

其余有幾個(gè)生產(chǎn)成品而非原料的廠家，技術(shù)內(nèi)幕不詳。如果做，應(yīng)該也是酵母菌表達(dá)。

一般的，用酵母表達(dá)，成本應(yīng)在600元/KG純蛋白以上，而目前的單位售價(jià)，大概在1000元/KG純蛋白以上（原料）。如果用大腸桿菌表達(dá)，300-400元/KG純蛋白或以下是可以做到的。但市場(chǎng)上應(yīng)該沒有大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品。

為什么懷疑（或推斷）大部分廠家是用酵母而不是大腸呢？我們實(shí)驗(yàn)室做酵母和大腸都很普遍了，我來猜一下，可能基于以下三個(gè)原因：

葉赫娜蘭.孤城

1，最早做人用蛋白時(shí)，首選是酵母，是由于早期提取工藝下回避毒性問題。后來雖然技術(shù)攻克了，但成本集中在后面資金運(yùn)作，所以也就不改了。如果（其實(shí)是只能）沿用人藥技術(shù)，而不做新的開發(fā)，沿用以往技術(shù)，是想當(dāng)然的選擇。

2，二硫鍵，用大腸做的優(yōu)勢(shì)在于高表達(dá)量，形成包涵體，二硫鍵的存在，對(duì)蛋白復(fù)性影響巨大，往往因?yàn)樗拇嬖诙鵁o法復(fù)性?，F(xiàn)在用的溶菌酶有兩個(gè)二硫鍵，折疊正確有一定困難。如果加信號(hào)肽，在酵母中表達(dá)并引出細(xì)胞，形成可溶性蛋白，則提取簡(jiǎn)單----過一遍柱子就行，無需復(fù)性。

3，工藝問題，搖瓶做包涵體可以達(dá)到總蛋白的20%以上，但到罐上就不長(zhǎng)了。關(guān)鍵是配方和工藝沒走通。做好這一步，國內(nèi)的SCI文章發(fā)了很多，但經(jīng)驗(yàn)，（相對(duì)于我們以往做抗生素的水平）是一點(diǎn)也沒有。

而我們實(shí)驗(yàn)室可以會(huì)避開以上問題。

作為微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和國家糖工程中心，做蛋白的折疊（包涵體復(fù)性）和糖基化，并非我們實(shí)驗(yàn)室的高端，但在國內(nèi)，在這方面，我們是理所當(dāng)然的權(quán)威。至于發(fā)酵罐工藝表達(dá)，先不必說你，我兩個(gè)老發(fā)酵的水平----這與我無關(guān)的----手上正好有與國外（原導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室）合作開發(fā)的一個(gè)工藝，適合大腸的外源蛋白表達(dá)。緣由是這樣的：

葉赫娜蘭.孤城

最早，為了培養(yǎng)碩士生，也與其他院校交流（其實(shí)是做點(diǎn)東西和國內(nèi)院校換DNA，當(dāng)然互相擔(dān)保不用于商業(yè)目的），開發(fā)過一個(gè)做感受態(tài)細(xì)胞的蛋清溶菌酶，搖瓶水平，閑著也是閑著，把復(fù)性也做了。后來知道與獸用溶菌酶是一個(gè)。如果擴(kuò)大，就套用做抗體的工藝就是了。所以，應(yīng)該沒有問題。這是一個(gè)成熟的工業(yè)水平工藝。

不僅如此，如果專利有任何東西可能撞車，（雖然我知道在工業(yè)水平是不可能的）我們都有技術(shù)力量合理規(guī)避開（僅僅出于實(shí)驗(yàn)室考慮，我們也會(huì)這么做）。

另外，在工藝方面，我們可以做交鑰匙工程，也可以和對(duì)方的技術(shù)人員協(xié)商解決，也可以先做可行性報(bào)告，不過，建議還是王兄做，一方面，你經(jīng)驗(yàn)多，我把情況介紹清楚，你還需要什么我再給，另一方面，如果我做，會(huì)套用原來的模板，那時(shí)的平均工資水平，定在6000元/年，相應(yīng)的動(dòng)力費(fèi)用，也太低，還得從頭算，太煩。呵呵，不過王兄非讓我做，我就上。

葉赫娜蘭.孤城

至于琥珀酸等有機(jī)酸發(fā)酵，小分子藥物，PHA,PHB,聚乳酸，是實(shí)驗(yàn)室賴以發(fā)家和申請(qǐng)課題經(jīng)費(fèi)的核心，也是我們的技術(shù)專長(zhǎng)，如果轉(zhuǎn)讓，可能價(jià)值不菲----雖然實(shí)際上，錢我們?cè)缫呀?jīng)在國家那里拿到了，但此事關(guān)系到實(shí)驗(yàn)室和整個(gè)生科院的聲譽(yù)。操作肯定要小心些。賢兄既然關(guān)心，我下次給你介紹清楚（很快，一兩天）。

賢兄身處此位，手頭企業(yè)資源比較豐富，看能讓我倆有何作為。在畜牧業(yè)，由于各國自然環(huán)境不同，人文環(huán)境不同，更有經(jīng)濟(jì)環(huán)境及結(jié)構(gòu)不同，國外產(chǎn)品其實(shí)不足訓(xùn)！如果真讓此等產(chǎn)品推廣了，也許，畜牧行業(yè)就開始走出了仿造國外產(chǎn)品的時(shí)代。這樣，于國于民，于人于己，都不算壞事。作為上世紀(jì)九十年代的重點(diǎn)高校畢業(yè)生，你我也可了慰此心吧。

國外產(chǎn)品不足訓(xùn)！----愿以此言，為一個(gè)好的開始。


                                                   弟，斌，即日

葉赫娜蘭.孤城

以上是和四川抗生素研究所的往來信件，談到溶菌酶，拿來放在這兒了。

1，不用WORD格式，省的弟兄們下載來下載去，煩。

2，不修改，雖然唐突，但是真實(shí)。

3，我的一家之言，錯(cuò)誤和片面處肯定不少，歡迎批評(píng)，指正。真的，渴望交流。

        坐在實(shí)驗(yàn)室，透過窗戶看出去，穿越層樓，是遠(yuǎn)處群山的山頂，風(fēng)云變時(shí)，姿態(tài)萬千。隨手抽屜內(nèi)，有綠茶花茶烏龍茶，歡迎各位到山大，同品茗觀雨，孤城當(dāng)側(cè)立執(zhí)壺以奉。

葉赫娜蘭-孤城 于 2009-4-9 17:13 補(bǔ)充以下內(nèi)容

弱弱的問一句，沒人留言嗎？批評(píng)也是好的啊。

葉赫娜蘭.孤城

分子生物學(xué)，并不是分子水平的生物，或生化，或生理學(xué)。其實(shí)，它是指分子水平的DNA學(xué)，除了DNA外, 對(duì)其他有機(jī)物也是圍繞與DNA的關(guān)系展開的?？紤]到在我們發(fā)酵生理學(xué)的視點(diǎn)下，DNA的價(jià)值，是蛋白的信息載體，而一切生理變化，都是蛋白活性的宏觀表達(dá)。那么，目前的生物技術(shù)，可以認(rèn)為只有兩個(gè)大的方面（或技巧）：1，通過分子水平DNA技術(shù)，抑制細(xì)胞內(nèi)源蛋白活性。2，表達(dá)細(xì)胞外源蛋白及其活性。

表現(xiàn)在宏觀上，就可以實(shí)現(xiàn)代謝流調(diào)控，蛋白產(chǎn)品的獲得，用外源酶合成或催化反應(yīng)等。比如像代謝流調(diào)控，我們找到編碼琥珀酸脫氫酶的基因，并敲除之，使這個(gè)蛋白不能表達(dá)，則從琥珀酸到延胡索酸的反應(yīng)不能進(jìn)行，來積累琥珀酸，屬于第一種情況。我們敲除PTSG這個(gè)基因，使細(xì)胞對(duì)各種不同的糖沒有選擇性，也屬于第一種情況，而引入另一個(gè)基因，使糖代謝加強(qiáng)，就是第二種情況了。在合成PHA時(shí)，外源基因指導(dǎo)合成三個(gè)外源酶，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)活性，就屬于第二種情況。當(dāng)然，表達(dá)外源蛋白最典型的，還是直接以被表達(dá)蛋白為產(chǎn)品，不過當(dāng)?shù)鞍仔枰恍揎棔r(shí)（如糖基化），就又需要這兩種技巧的配合或反復(fù)使用了。

這樣得到的菌株，生產(chǎn)產(chǎn)物的代謝十分直接，往往轉(zhuǎn)化率在90%或以上。但是，細(xì)胞本身的活力比較弱，也會(huì)有大量的宏觀上類似回復(fù)突變的生理問題。這就是為什么我說：“現(xiàn)代發(fā)酵，分子調(diào)控，菌種和工藝是分不開的，有時(shí)，工藝唯一的目的，就是保證菌種處于某種特定狀態(tài)而已?！?---因?yàn)?，許多本來由我們過程工程師在生理水平控制的代謝，分子技術(shù)已經(jīng)幫我們?cè)诜N子階段解決了，而同時(shí)，又丟給我們一些不大不小的新問題。

以往，類似味精發(fā)酵，獲得初級(jí)代謝產(chǎn)品，并減少中間代謝產(chǎn)物和副產(chǎn)物，需要工藝近似苛刻的控制，而現(xiàn)在，就不必了。