評價飼料酶質(zhì)量的5種指標(biāo)

mche2005 · 發(fā)表于 2009-5-3 10:45:21

評價飼料酶質(zhì)量的5種指標(biāo)
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目前，關(guān)于飼料酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的報(bào)道很多，從報(bào)道的內(nèi)容分析，無論是生產(chǎn)水平還是質(zhì)量鑒別能力都比以前有很大提高，但是目前還有很多問題需要研究。
目前廣泛使用的植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果膠酶都有很多同功酶。只要產(chǎn)酶的微生物不同（工程菌除外），酶蛋白的結(jié)構(gòu)通常也是不同的。根據(jù)最近的研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶（可能是結(jié)構(gòu)最簡單的飼料酶）至少有30種的同功酶，它們的活力表現(xiàn)隨pH值的變化情況都是不同的。至于其它飼料酶，例如木聚糖酶，至少有200種同功酶。
很多飼料酶使用者希望能有一套類似NRC的飼料酶使用標(biāo)準(zhǔn)或模板，供行業(yè)參考。事實(shí)上這幾乎是不可能的，至少在最近的數(shù)十年內(nèi)這種設(shè)想還不成熟。飼料酶的質(zhì)量評判和選用涉及很多因素，遠(yuǎn)比普通的工業(yè)用酶復(fù)雜。一般的工業(yè)用酶，如淀粉酶和糖化酶，它們的使用場合比較固定，有比較確定的pH值、溫度、底物和作用時間，而且酶活成分也比較單一明確。但是對于飼料酶，由于飼料原料、加工要求和動物消化道pH的多樣性，需要考慮的因素很多、很復(fù)雜。
   動物飼養(yǎng)試驗(yàn)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，同樣活力的飼料酶，使用效果會不一樣，而且有時差異還很大。如：①同樣是5 000U/g的植酸酶，而且酶活定義和測定方法都符合GB/T18634—2002，為什么在蛋雞料中A酶需要添加100g/t才能達(dá)到與B酶添加60g/t同樣的效果？②為什么有的酶在蛋雞料中有效果而在生長豬料中效果很小，而有些酶無論在豬料還是在雞料中都有較好的效果？③為什么有些酶在仔豬料中有效果而在生長豬料中沒有效果？要回答這些問題，需要對飼料酶產(chǎn)品中酶活成分以及影響酶活力的因素進(jìn)行詳細(xì)的分析。分析的因素主要有：酶活力定義、pH值、溫度、反應(yīng)時間、底物性質(zhì)及其濃度、耐酸穩(wěn)定性等。關(guān)于酶活測定溫度、反應(yīng)時間比較容易理解。飼料酶的活力測定溫度一般都選擇在37～ 40℃，反應(yīng)時間選擇在15～30min。關(guān)于酶活力的定義，目前已經(jīng)逐步改變了前幾年的混亂局面，多數(shù)使用國際單位，即每分鐘內(nèi)從底物溶液中降解釋放1μmol還原產(chǎn)物所需要的酶量。需要重點(diǎn)考察的是pH值、耐酸穩(wěn)定性和作用底物。
1  pH值對酶活力的影響
由于動物消化道食糜的pH值變化范圍很大，所以單純考慮在某個pH值條件下的酶活表現(xiàn)值是不全面的，最好能測定該酶活組分在比較廣泛的pH值范圍內(nèi)的活力表現(xiàn)。如圖1所示，兩種植酸酶A和B酶活比較。

植酸酶A在pH5.5時有一個高峰值，而在其它pH條件下表現(xiàn)活力都很低。當(dāng)pH值低于3.5以后基本沒有活力。但是植酸酶B不僅在pH5.5有一個峰值，在pH2.5時也有一個峰值，其作用范圍要比植酸酶A寬得多，使用效果也要優(yōu)于A。顯然，要想達(dá)到同樣的使用效果，植酸酶A的添加量必須高于B。
2 酶反應(yīng)底物的分析
底物的類型對酶活的測定值有很大影響，比較典型的是纖維素酶活力的測定，見表1。

纖維素酶是一種復(fù)合酶，天然的纖維素都是不溶解于水的高分子聚合物，降解這種聚合物需要多種酶活力的協(xié)同組合。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，有實(shí)際使用價值的纖維素酶至少含有4種活性（C1酶、Cx酶、纖維二糖酶和 β-葡萄糖苷酶）。濾紙酶活（FPA）體現(xiàn)了各活性組分的復(fù)合效應(yīng)，比較符合纖維素酶的實(shí)際使用效果。CMCase（以羧甲基纖維素為底物的纖維素酶測定值）沒有體現(xiàn)C1酶的效應(yīng)（把天然的結(jié)晶纖維素分解為可溶于水的游離纖維素），而在實(shí)際使用過程中C1酶通常是限速反應(yīng)的關(guān)鍵酶。顯然，以FPA作為選擇飼料纖維素酶的依據(jù)比CMCase更合理（即選擇纖維素酶B比較好）。但是，準(zhǔn)確測定FPA比較困難，而且數(shù)值也比較低，目前絕大多數(shù)纖維素酶產(chǎn)品的活力都是以CMCase來表示（包括國外）。
木聚糖酶是第二大飼料用酶，對它的研究也很多。相對而言，木聚糖酶的結(jié)構(gòu)要比植酸酶復(fù)雜，影響的因素也更多。木聚糖酶主要有二大類：造紙用木聚糖酶和飼料用木聚糖酶。造紙用的木聚糖酶的測定底物是樺木木聚糖（birchwood xylan），而飼料用木聚糖酶的測定底物是燕麥木聚糖（oat xylan）。因此根據(jù)表2的分析結(jié)果，選擇木聚糖酶A作為飼料用酶比較合理。
那么如果都采用燕麥木聚糖（Sigma X0627）作為底物，其它測定條件也一樣。比較如下2種木聚糖酶C和D（見圖2），在pH值2.0～7.0的范圍內(nèi)，木聚糖酶C的表現(xiàn)值始終高于木聚糖酶D，是否就可以確定木聚糖酶C優(yōu)于D呢？
用無淀粉麥麩作為實(shí)際作用底物進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與圖2顯示的結(jié)果相反，木聚糖酶D優(yōu)于C（見圖3）。
   在200ml醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.5）中加入10.0g無淀粉麥麩和0.50g木聚糖酶，在40℃保溫8.0h。木聚糖酶D可以降解20.5%的麥麩，而木聚糖酶C只能降解18.7%的麥麩，其原因與纖維素酶的情況類同。試驗(yàn)使用的木聚糖酶是一個復(fù)合酶，燕麥木聚糖（Sigma X0627）是溶于水的，而在飼料中存在的木聚糖絕大多數(shù)是不溶于水的。
3 酶蛋白的耐酸穩(wěn)定性
   飼料酶的耐酸穩(wěn)定性也是考察飼料酶質(zhì)量的一個指標(biāo)，如圖4、圖5、圖6和圖7所示，比較米曲霉和黑曲霉發(fā)酵物中的酶活力。
除了果膠酶以外，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中的各酶活幾乎都要比米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中的活性高。使用在仔豬料中，黑曲霉發(fā)酵物的效果要優(yōu)于米曲霉發(fā)酵物；但是，添加在生長豬料中發(fā)現(xiàn)米曲霉發(fā)酵物要優(yōu)于黑曲霉發(fā)酵物。通過耐酸性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，米曲霉發(fā)酵物中酶蛋白的耐酸性要明顯優(yōu)于黑曲霉發(fā)酵物。在pH值2.5的條件下40℃保溫2h，米曲霉發(fā)酵物中的木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纖維素酶的酶活損失都不超過20%，而黑曲霉發(fā)酵物中的酶活損失幾乎都超過了70%（見表3）。
但是在pH值大于4.0的條件下，這2組酶系均有很好的穩(wěn)定性。在pH4.0的條件下40℃保溫2 h，酶活力損失均不超過20%（見表4）。
生長豬胃酸較多，pH值很低，對黑曲霉發(fā)酵物的活性成分破壞較大。而仔豬胃酸較少，pH值在4.0左右，對黑曲霉發(fā)酵物的活性破壞較少。
4 關(guān)于液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的分析
目前，國內(nèi)幾乎所有液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料酶的企業(yè)都宣傳液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)品優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)品，很多從事動物營養(yǎng)學(xué)研究的科研工作者也贊同這個觀點(diǎn)。事實(shí)上這個論點(diǎn)有很大的片面性，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)在中國、印度、巴西等發(fā)展中國家存在，在日本、荷蘭等一些發(fā)達(dá)國家也很受重視（主要是能耗低和基本沒有污染排放），固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量也很好。如果產(chǎn)酶菌是霉菌（事實(shí)上天然的酶制劑高產(chǎn)菌大多數(shù)是霉菌），相對液態(tài)發(fā)酵而言，固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)品有以下2個方面的優(yōu)勢：①酶蛋白屬于次級代謝產(chǎn)物。霉菌的次級代謝產(chǎn)物通常是在霉菌進(jìn)行分化時形成的。液態(tài)培養(yǎng)抑制霉菌分化，所以霉菌固態(tài)發(fā)酵單位體積的酶產(chǎn)量往往比液態(tài)發(fā)酵高5～10倍；②固態(tài)發(fā)酵的原料比較粗放，終產(chǎn)物往往含有多種酶活性，很適合于用作飼料添加劑。而液態(tài)發(fā)酵的酶系往往比較單一，往往只有一種酶活比較高，而其它組分的酶活很小。
   飼料原料中含有很多非淀粉多糖，分解這些非淀粉多糖需要一組或多組酶系的共同協(xié)作才能完成。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的非淀粉多糖酶通常都含有多個亞基甚至多個酶系，固態(tài)發(fā)酵的底物基本上都是農(nóng)副產(chǎn)品（主要是麥麩），底物的誘導(dǎo)效應(yīng)使得發(fā)酵產(chǎn)生的酶系有很好的針對性。在酶活測定值相等的條件下，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的酶在飼料中顯示的效果往往要比液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的酶更為顯著。
   固態(tài)發(fā)酵最大的缺點(diǎn)是機(jī)械化程度低，勞動強(qiáng)度大，很難進(jìn)行細(xì)菌和酵母的培養(yǎng)。目前高產(chǎn)酶的基因工程菌基本上都是酵母菌和細(xì)菌，只能采用液態(tài)發(fā)酵。
固態(tài)發(fā)酵主要有托盤式、厚層通風(fēng)式和轉(zhuǎn)鼓式3種。托盤式產(chǎn)量最小，但是具有投資少、操作簡便和產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)很多企業(yè)采用這種方式，利潤空間也比較大。托盤式發(fā)酵生產(chǎn)一噸成品原曲需要耗費(fèi)32～36個勞動日，這在西方發(fā)達(dá)國家是難以承受的，但是在發(fā)展中國家目前還是可以操作的。
5 耐熱和儲存穩(wěn)定性
耐熱穩(wěn)定性需要考察二種情況，一種是干物質(zhì)的耐熱性能，另一種是在水溶液中（或高水分條件下）的穩(wěn)定性。有報(bào)道說某種飼料酶耐熱性能很好，可以耐受飼料的高溫制粒而不失活，這種說法是不全面的，有些酶在干物質(zhì)條件下有很好的穩(wěn)定性，但是在高溫水溶液中（或含水量很高的物料中）會很快失活。筆者曾測試一種木聚糖酶，在干粉（含水量不超過10.0%）條件下，105℃保溫2h，酶活損失不超過10.0%，但是在80℃水溶液中保溫5min，酶活損失超過40.0%。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種木聚糖酶在飼料的高溫制粒（85～90℃）過程中活力損失通常要超過24.0%。當(dāng)然，如果不考慮高溫制粒，筆者建議優(yōu)先選擇價格比較低廉而且活力比較高的粉狀飼料酶。
儲存穩(wěn)定性對于某些酶產(chǎn)品是必須考慮的。有些霉菌產(chǎn)纖維素酶的能力很強(qiáng)，但是產(chǎn)品的儲存穩(wěn)定性很差。即使在冬季（環(huán)境溫度不超過15℃）存放3個月，活力損失也要超過50.0%。顯然，這種情況無論是對于生產(chǎn)企業(yè)還是用戶都要引起重視。
飼料酶質(zhì)量的評價涉及很多因素，很多科研工作者在這個領(lǐng)域進(jìn)行了大量工作，積累了很多經(jīng)驗(yàn)。但是由于問題的復(fù)雜性，目前還沒有成型的公式可以參考。以前筆者曾設(shè)想通過實(shí)驗(yàn)室的酶活分析來推算其使用效果，并發(fā)表了一些這方面的言論，現(xiàn)在看來，有些觀點(diǎn)是片面的、甚至是錯誤的。關(guān)于飼料酶的研究，我們僅僅處于起步階段，不知道的遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于知道的。