豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)之十一、偽狂犬病檢測(cè)方法

nnii521 · 發(fā)表于 2009-6-24 21:17:54

十一、偽狂犬病檢測(cè)方法

偽狂犬病病毒分離鑒定
1 材料準(zhǔn)備

DMEM培養(yǎng)基、BHK-21細(xì)胞、新生犢牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、0.22ul微孔濾膜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。溶液配制見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
2操作步驟
2.1
病料的采集  對(duì)于剛死亡或活體送檢并處死的動(dòng)物，無菌采取肝、脾、肺、腎及其腦組織，尤其是三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球， 4℃送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
2.2
樣品處理  待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生理鹽水或DME培養(yǎng)基制成1：5乳劑， —70℃反復(fù)凍融后，經(jīng)3000rpm離心30分鐘后，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，加入青鏈霉素溶液至最終濃度為100U/mL， —70℃保存作為接種材料。
2.3
病料接種
將病料濾液接種已長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，接種量為培養(yǎng)基量的10%，37℃恒溫箱中吸附1小時(shí)后，加入含10%新生犢牛血清（經(jīng)過56℃水浴滅活30分鐘，過濾除菌，無支原體）的DMEM培養(yǎng)基，置37℃溫箱中培養(yǎng)。
2.4 觀察結(jié)果  接種后24—48小時(shí)，BHK-21細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cyto pathogenic effect, CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，脫落。如第一次接種不出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無CPE，則判為偽狂犬病病毒陰性。
2.5
病毒的鑒定
將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融后，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光抗體試驗(yàn)等兩種方法中任一方法作進(jìn)一步鑒定。

偽狂犬病聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
1 材料準(zhǔn)備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K，十二烷基磺酸鈉（SDS），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、TEN緩沖液。溶液配制見附錄C(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)

引物：擴(kuò)增偽狂犬病病毒基因中434—651bp之間217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列為，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，

下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3

  儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀， PCR擴(kuò)增儀，電泳儀
2操作步驟：
2．1 樣品的采集：對(duì)于病死或撲殺動(dòng)物，取腦組織；對(duì)于待檢活豬，用已滅菌的棉簽，伸入豬鼻腔中，采取鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條件送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
2.2 樣品處理  所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70℃反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min，如樣品為鼻試子，則加入2ml
TEN緩沖液，充分?jǐn)D壓，取出棉簽，7000rpm，離心5分鐘，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl雙蒸水溶解，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/FONT>
2.3.
PCR的操作程序
先將制備的模板DNA置100℃水浴10分鐘作變性處理，，然后立即放于冰浴中。PCR反應(yīng)體系為：總體積25μl，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1％Triton X-100，100μmol/L dNTPs，0.35μmol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1μl模板DNA。
常用的反應(yīng)體系組成如下

10×緩沖液
2.5 μl

15mM MgCl2
2.5 μl

dNTPs
2.0 μl

引物
各2.0μl

Taq聚合酶
1.0μl

DNA模板
2.0μl

滅菌去離子水
11.0μl

礦物油
約 20μl

擴(kuò)増條件為:94℃變性3分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃60秒，65℃60秒，72℃60秒，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5分鐘。
2.4
PCR產(chǎn)物的檢測(cè)
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結(jié)果。為進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性鑒定，可取PCR產(chǎn)物用SalI酶切，酶切產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，可見產(chǎn)生的140bp和77bp兩個(gè)片段。

偽狂犬病熒光抗體試驗(yàn)
1材料準(zhǔn)備：碳酸鹽緩沖甘油、磷酸鹽緩沖液、丙酮（分析純），偽狂犬病熒光抗體、冰凍切片機(jī)，熒光顯微鏡。溶液配制見附錄D(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
2操作步驟
2．1樣品采集
撲殺可疑動(dòng)物，取大腦、淋巴結(jié)、扁桃體迅速送檢實(shí)驗(yàn)室，如不能及時(shí)送出，必須凍結(jié)保存，避免腐敗、自溶。本法也可用于對(duì)疑似偽狂犬病病毒的培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。
2．2
切片制備
將樣品組織塊切成1cm
×1cm的面，不經(jīng)任何固定處理，直接貼于冰凍切片托上，進(jìn)行切片，切片厚度要求5—7um，將切片展貼于0.8mm×1mm厚的潔凈載
玻片上。
2．3固定：將切片置純丙酮中固定15分鐘，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸
鹽緩沖液中，輕輕漂洗3—4次，取出，自然干燥后盡快進(jìn)行熒光抗體染色。
2．4 染色
將偽狂犬病熒光抗體滴加于切片表面，置溫盒內(nèi)于37℃作用30分鐘，取出后放入磷酸鹽緩沖液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.0—9.5碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片（0.1mm厚），染色后應(yīng)盡快鏡檢，必要時(shí)可放置低溫待檢。
2．5
觀察
將染色后的切片標(biāo)本置激發(fā)光為藍(lán)紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。
2．6判定：于熒光顯微鏡視野中，見細(xì)胞中出現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，判為偽狂犬病病毒感染陽性。

偽狂犬病微量中和試驗(yàn)（固定病毒，稀釋血清法）
1 材料準(zhǔn)備
0.
25%胰酶（配制見附錄B）、BHK-21細(xì)胞,多道可調(diào)微量移液器, ,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,CO2培養(yǎng)箱, 倒置顯微鏡。
2 操作步驟
2.1
病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定：
2.1.1
病毒培養(yǎng)和收獲
將偽狂犬病毒接種于長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，接種量為液體培養(yǎng)基量的10%,37℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)病變后，凍融，收獲病毒。
2.1.2
病毒的滴定
用DMEM培養(yǎng)基將偽狂犬病病毒作連續(xù)10倍稀釋，即10—1、10—2……每個(gè)稀釋度取100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨后加入經(jīng)0.25%胰酶消化的BHK-21細(xì)胞100μL（細(xì)胞含量以105/mL左右為宜），每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照。置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中。

2.1.3
TCID50計(jì)算
逐日觀察細(xì)胞病變，并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，直到對(duì)照細(xì)胞老化脫落為止。按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50（具體的計(jì)算示例見附錄B）。
2.2
中和試驗(yàn) 將無菌采集的待檢豬血清置56℃水浴滅活30分鐘。用DMEM培養(yǎng)基作倍比稀釋，在細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入50μL培養(yǎng)基，隨后在第一孔中加入經(jīng)待檢豬血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混勻后取出50μL再加入第三孔中，依此類推。血清稀釋度即為1：2、1：4、1：8……，每份待檢血清稀釋度作2—4個(gè)重復(fù)。將50μL含200個(gè)TCID50的病毒液加入到不同稀釋度血清孔中，37℃作用1小時(shí)，每孔中再加入100μL經(jīng)胰酶消化分散的BHK-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、陽性血清、陰性血清，待檢血清、正常細(xì)胞對(duì)照。
2.3計(jì)算抗體中和效價(jià)
逐日觀察，直至細(xì)胞對(duì)照出現(xiàn)老化脫落為止，按Reed-Muench兩氏法，計(jì)算抗體中和效價(jià)。如抗體效價(jià)為1：2及1：2以上，則判為偽狂犬病抗體陽性。

偽狂犬病酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接法）
1材料準(zhǔn)備：抗原、酶標(biāo)抗體，底物（OPD—H2O2），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；溶液配制見附錄F(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
2
操作步驟：
2.1
包被將PRV抗原加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100uL，37℃作用1h后置4℃冰箱過夜。
2.2
洗滌棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干
2.3
封閉各孔加入封閉液100uL 37℃作用1h。按2.2步驟洗滌
2．4
加入待檢血清 待檢血清經(jīng)56oC30分鐘滅活將待檢血清用洗滌液稀釋，每孔100uL，37℃作用1h。重復(fù)2.2步驟。
2．5
加入酶標(biāo)抗體  用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋，每孔100uL，37℃作用1h。重復(fù)2.2步驟。
2．6
加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。
2．7
終止反應(yīng) 每孔加入50uL終止液終止反應(yīng)。
2．8
測(cè)定OD值  在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。
2．9血清陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定  取60份經(jīng)中和試驗(yàn)檢測(cè)為PRV抗體陰性的豬血清，按1:20稀釋后進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，規(guī)定以60份血清的平均OD值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為判定陰陽性的臨界值。

偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)
1材料準(zhǔn)備：偽狂犬病乳膠凝集抗原、偽狂犬病陽性血清、陰性血清、稀釋液，玻片，溶液配制見附錄E(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
2操作步驟：
2．1待檢血清不須經(jīng)熱滅活或其它方式的滅活處理
2．2將待檢血清用稀釋液作倍比稀釋后，各取15μL與等量乳膠凝集抗原在潔凈干燥的玻片上用竹簽攪拌充分混合，在3—5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結(jié)果，即：

100%凝集：混合液透亮，出現(xiàn)大的凝集塊

75%凝集：混合液幾乎透明，出現(xiàn)大的凝集塊

50%凝集：約50%乳膠凝集，凝集顆粒較細(xì)

25%凝集；混合液渾濁，有少量凝集顆粒

0%凝集：混合液渾濁，無凝集顆粒出現(xiàn)

如出現(xiàn)50%凝集程度以上的（含50%凝集程度），判為偽狂犬病抗體陽性，否則判為抗體陰性。如為陰性，可用微量中和試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)。

偽狂犬病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)
1材料準(zhǔn)備
瓊脂擴(kuò)散抗原、陰性血清和陽性血清；優(yōu)質(zhì)瓊脂粉、平皿
2操作步驟
2．1 0.8%瓊脂板的制作
將1克瓊脂粉溶于100毫升Tris─鹽酸緩沖液(Tris 6.5克, NaCl 2.9克, NaN3 0.2克, 蒸餾水 1000毫升, 用HCl調(diào)pH值至7.2)中，趁熱傾倒于玻璃平皿上，厚度為2—3mm，待冷卻凝集后，打孔，中央一孔，周圍6孔，孔徑為2mm，周圍孔之間距離2mm，周圍孔與中央孔間距為4mm—6mm，用酒精燈微熱封底。
2．2加樣
將瓊脂擴(kuò)散抗原加到中央孔中，周圍孔加經(jīng)熱滅活的待檢血清，設(shè)陰性血清和陽性血清對(duì)照。置溫盒37℃作用，24—48小時(shí)后觀察結(jié)果。
2．3結(jié)果判定
在抗原孔與待檢血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，抗體可判為陽性；如待檢血清抗體水平較低，可以觀察到與待檢血清相鄰的陽性血清沉淀線末端略向抗原抗彎曲。陰性血清與抗原孔之間則沒有沉淀線。

偽狂犬病區(qū)分強(qiáng)弱毒感染鑒別乳膠凝集試驗(yàn)

1．豬偽狂犬病gG鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)
偽狂犬病gG鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)是用偽狂犬病毒gG基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物致敏乳膠抗原來檢測(cè)動(dòng)物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gG基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。
1．1材料準(zhǔn)備：偽狂犬病毒gG蛋白致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒陽性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸頭等。
1．2操作步驟
1．2．1對(duì)照試驗(yàn)
檢測(cè)之前應(yīng)做對(duì)照試驗(yàn)，出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則應(yīng)重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結(jié)果則停止使用：偽狂犬病毒陽性血清加gG蛋白致敏乳膠抗原呈陽性凝集；注射gG基因缺失疫苗血清加gG蛋白致敏乳膠抗原呈陰性凝集；偽狂犬病毒陽性血清與注射gG基因缺失疫苗血清加偽狂犬病毒致敏乳膠抗原均呈陽性凝集。
1．2．2檢測(cè)試驗(yàn)
1．2．2．1待檢血清不須經(jīng)熱滅活或其它方式的滅活處理
1．2．2．2待檢血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動(dòng)1-2分鐘，于3-5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果(注：gG蛋白致敏乳膠抗原與血清反應(yīng)的凝集顆粒較細(xì))；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結(jié)果，即：

“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；

“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；

“++”約一半乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁；

“+”有少許凝集，液體呈混濁；

“—”液滴呈原有的均勻乳狀。
以出現(xiàn)“++”以上凝集者判為陽性凝集。
2．豬偽狂犬病gE鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)
偽狂犬病gE鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)是用偽狂犬病毒gE基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物致敏乳膠抗原來檢測(cè)動(dòng)物血清、全血或乳汁中抗gE蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gE基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。
1．1材料準(zhǔn)備：偽狂犬病毒gE蛋白致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒陽性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸頭等。
1．2操作步驟
1．2．1對(duì)照試驗(yàn)
檢測(cè)之前應(yīng)做對(duì)照試驗(yàn)，出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則應(yīng)重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結(jié)果則停止使用：偽狂犬病毒陽性血清加gE蛋白致敏乳膠抗原呈陽性凝集；注射gE基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳膠抗原呈陰性凝集；偽狂犬病毒陽性血清與注射gE基因缺失疫苗血清加偽狂犬病毒致敏乳膠抗原均呈陽性凝集。
1．2．2檢測(cè)試驗(yàn)
1．2．2．1待檢血清不須經(jīng)熱滅活或其它方式的滅活處理
1．2．2．2待檢血清一滴，置于玻片上。加gE蛋白致敏乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動(dòng)1-2分鐘，于3-5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果(注：gE蛋白致敏乳膠抗原與血清反應(yīng)的凝集顆粒較細(xì))；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結(jié)果，即：

“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；

“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；

“++”約一半乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁；

“+”有少許凝集，液體呈混濁；

“—”液滴呈原有的均勻乳狀。
以出現(xiàn)“++”以上凝集者判為陽性凝集。

偽狂犬病區(qū)分強(qiáng)弱毒感染鑒別ELISA
1．偽狂犬病gG-ELISA鑒別診斷（間接法）
偽狂犬病gG-ELISA鑒別診斷是用偽狂犬病毒gG基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物包被的ELISA板用來檢測(cè)動(dòng)物血清中抗gG蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gG基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。
1．1材料準(zhǔn)備：gG蛋白包被的ELISA板、酶標(biāo)抗體，底物（OPD—H2O2），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；溶液配制見附錄F(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
1．2
操作步驟：
1．2.1加入待檢血清 待檢血清經(jīng)56oC30分鐘滅活后用保溫液作40倍稀釋，每孔加入，37℃作用30min。
1．2.2
洗滌棄去孔內(nèi)液體，每孔用200uL洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干。
1．2.3 加入酶標(biāo)抗體  用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋，每孔100uL，37℃作用30min,重復(fù)2.2步驟。
1．2．4
加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。
1．2．5 終止反應(yīng) 每孔加入50uL終止液終止反應(yīng)。
1．2．6
測(cè)定OD值  在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，記為P值，陰性對(duì)照OD值記為N值，N值如小于0.1時(shí)，按0.1計(jì)算，大于0.1時(shí)為實(shí)際值。當(dāng)陽性對(duì)照孔OD值―陰性對(duì)照OD值大于0.25時(shí)，試驗(yàn)成立。
1．2．7結(jié)果判定：
P/N≥2.1判為gG抗體陽性
P/N≤1.9判為gG抗體陰性,
1.9<P<N2.1,判為可疑
2．偽狂犬病gE-ELISA鑒別診斷（間接法）
偽狂犬病gE-ELISA鑒別診斷是用偽狂犬病毒gE基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物包被的ELISA板用來檢測(cè)動(dòng)物血清中抗gE蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gE基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。
2．1材料準(zhǔn)備：gE蛋白包被的ELISA板、酶標(biāo)抗體，底物（OPD—H2O2），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；溶液配制見附錄F(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
2．2
操作步驟：
2．2.1加入待檢血清 待檢血清經(jīng)56oC30分鐘滅活后用保溫液作40倍稀釋，每孔加入，37℃作用30min。
2．2.2
洗滌棄去孔內(nèi)液體，每孔用200uL洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干。
2．2.3 加入酶標(biāo)抗體  用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋，每孔100uL，37℃作用30min,重復(fù)2.2步驟。
2．2．4
加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。
2．2．5 終止反應(yīng) 每孔加入50uL終止液終止反應(yīng)。
2．2．6
測(cè)定OD值  在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，記為P值，陰性對(duì)照OD值記為N值，N值如小于0.1時(shí)，按0.1計(jì)算，大于0.1時(shí)為實(shí)際值。當(dāng)陽性對(duì)照孔OD值―陰性對(duì)照OD值大于0.25時(shí)，試驗(yàn)成立。
2．2．7結(jié)果判定：
P/N≥2.1判為gE抗體陽性
P/N≤1.9判為gE抗體陰性
1.9<P<N2.1,判為可疑
偽狂犬病病毒血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗(yàn)方法
（一）紅血球的制備：將小白鼠尾尖剪斷，插入盛有滅菌的阿氏液的離心管的抽氣瓶中，負(fù)壓抽吸，采血完畢后，將離心管取出，用PBS洗滌3次，每次1 500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，使用時(shí)加PBS配成0.1%的紅血球懸液。
（二）待測(cè)血清的預(yù)處理：取待測(cè)血清0.1毫升加PBS 0.3毫升，56℃滅活30分鐘，加入0.4毫升 25%白陶土25℃振蕩1小時(shí)，離心取上清液加入0.1毫升配好的0.1%紅血球懸液37℃作用1小時(shí),離心除去紅血球,上清液作為1:8稀釋的血清用于HI試驗(yàn).

（三） HA試驗(yàn)操作:選用96孔V型板每孔加入PBS 50微升,在第一排孔的前6孔內(nèi)加入50微升 PrV病毒液,后兩孔作為空白對(duì)照,用微量加樣器作倍比稀釋,從1:2至1:1024,即將第一排孔病毒液混勻后吸出50微升至第二排孔均勻混合,再從第二排孔吸出50微升至第三排孔,依次類推至最后一排孔取50微升棄掉,每孔加入50微升 0.1%的紅血球，在振蕩器較微振蕩混合均勻，以一定的溫度作用2小時(shí)，觀察結(jié)果，以完全凝集紅血球的最大稀釋倍數(shù)作為一個(gè)血凝單位。

（四）HI試驗(yàn)操作：在96孔V型板中每孔加入50微升 PBS液，然后在第一排孔的前6孔內(nèi)加入50微升已處理的血清作為對(duì)照，用微量加樣器將血清倍比稀釋從1：2至1：1 024，然后各孔加入50微升用PBS稀釋好的4個(gè)血凝單位的病毒液，每孔分別加入50微升 0.1%紅血球懸液，混合均勻后室溫放置2小時(shí)，觀察結(jié)果。

(吳
斌
何啟蓋)

進(jìn)口偽狂犬病抗體檢測(cè)試劑盒（用于普查）

一、
試劑
貯存在2-7℃
1．PRV包被酶標(biāo)板

5塊
2．抗豬辣根過氧化物酶（HRP）連結(jié)物（酶標(biāo)抗體）
60ml
3．PRV陽性對(duì)照血清
4ml
4．PRV陰性對(duì)照血清
4ml
5．樣品稀釋液

175ml
6．洗滌液（10×）
250ml
7．TMB底物
60ml
8．終止液                                                             60ml
二、樣品的準(zhǔn)備
用樣品稀釋液按1：20稀釋待檢血清。（如20ul樣品加380ul樣品稀釋液）。注意：
陰、陽性對(duì)照不稀釋。
每一樣品必須更換吸嘴，并記錄樣品在板上的位置，在樣品加到酶標(biāo)孔內(nèi)之前必
須混合均勻。
三、洗滌液的準(zhǔn)備
濃縮洗滌液（10×）應(yīng)置室溫并搖動(dòng)使沉淀的鹽能充分溶解。在用之前，濃縮洗滌
液（10×）應(yīng)用蒸餾水或去離子水接1：10稀釋（如30ml濃縮洗滌液加 270ml蒸餾水或去離子水即可用于一塊板的洗滌）。
四、試驗(yàn)過程
在使用之前所有試劑必須置室溫并輕輕搖動(dòng)或渦旋。
1．取出酶標(biāo)板并記錄樣品在板上的位置。
2．在A1、A2、A3孔內(nèi)各加未稀釋的陰性對(duì)照100ul。
3．在A4、A5、A6孔內(nèi)各加未稀釋的陽性對(duì)照100ul。
4．加100ul已稀釋的樣品（1：20）到相應(yīng)的孔內(nèi)，每一樣品應(yīng)同時(shí)做2孔。
5．室溫作用30分鐘。
6．傾去孔內(nèi)液體到廢液缸內(nèi)。
7．每孔用近300ul的洗滌液洗3-5次，每次洗后傾去孔內(nèi)的液體。在加酶標(biāo)抗體之前
應(yīng)避免孔內(nèi)干燥，最后一次洗滌后應(yīng)在吸水材料上拍干酶標(biāo)板。
8．
在每一孔內(nèi)加入100ul抗豬的酶標(biāo)抗體。
9．
室溫作用30分鐘。
10．重復(fù)步驟6和7。
11．在每一孔內(nèi)加入TMB底物溶液100ul。
12．室溫顯色15分鐘。
13．每一孔內(nèi)加入100ul終止劑以終止反應(yīng)。
14．空氣調(diào)零。
15．在650nm測(cè)量并記錄樣品和對(duì)照的吸收值。
16．計(jì)算結(jié)果。
五、結(jié)果
陽性對(duì)照的平均值（PCX）與陰性對(duì)照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于0.15時(shí)試驗(yàn)方成立。而且陰性對(duì)照平均值（NCX）必須小于或等于0.15。
如果試驗(yàn)不成立，可能操作有誤，試驗(yàn)應(yīng)在熟悉產(chǎn)品說明書后重試。
每一樣品內(nèi)針對(duì)PRV抗體的有無是由樣品與陽性對(duì)照的比率（S/P）來確定。陽性對(duì)照已標(biāo)準(zhǔn)化且有很高水平的PRV抗體。
六、
結(jié)果的說明
1．S/P比值小于0.4的樣品確定為PRV抗體陰性。
2．S/P比值大于或等于0.4的樣品確定為PRV抗體陽性。在該試驗(yàn)中定為陽性的樣品
應(yīng)再用“偽狂犬病抗體確認(rèn)試劑盒”來進(jìn)一步證明其陽性的真假。
七、計(jì)算
1．
陰性對(duì)照平均值（NCX）的計(jì)算

A1A（650）+A2A（650）+A3A（650）
0.06+0.063+0.069
NCX= —————————————————— 例如：————————=0.064

3
3

2．
陽性對(duì)照平均值（PCX）的計(jì)算

A4A（650）+A5A（650）+A6A（650）
0.313+0.299+0.33
NCX= —————————————————— 例如：————————=0.314

3
3

3．
S/P比值的計(jì)算                例如：某樣品平均值=0.350

Sample A（650）—NCX
0.350-64
0.286
S/P= ————————————
S/P= —————— = ———— =1.14

PCX—NCX
0.314-0.064
0.250

（華中農(nóng)大覃雅麗、唐勇譯）

偽狂犬病gE抗體試劑盒（進(jìn)口）

一、試劑
貯存在2-7℃
1.
PRV包被酶標(biāo)板

6塊
2.
抗 PRV-gE辣根過氧化物酶（HRP）連結(jié)物（酶標(biāo)抗體）
60ml
3.
陰性豬血清對(duì)照-不與PRV-gE 反應(yīng)的豬血清
5ml
4.
陽性對(duì)照血清-抗PRV-gE
5ml
5.
樣品稀釋液

120ml
6.
洗滌液（10×）
235ml
7.
TMB底物
60ml
8.
8．終止液                                                          60ml
二、樣品的準(zhǔn)備
用樣品稀釋液按1：2 的比例稀釋待檢血清。每一樣品必須更換吸嘴，樣品加到酶標(biāo)孔內(nèi)之前必須混合均勻。
三、洗滌液的準(zhǔn)備
濃縮洗滌液（10×）應(yīng)平衡到室溫，搖動(dòng)使沉淀的鹽能充分溶解。在用之前，濃縮洗滌液（10×）應(yīng)用蒸餾水或去離子水按1：10稀釋（如30ml濃縮洗滌液加 270ml蒸餾水或去離子水即可用于一塊板的洗滌）。
四、試驗(yàn)過程
在使用之前所有試劑必須平衡到室溫，用前輕輕搖動(dòng)混勻。
1．取出酶標(biāo)板在記錄紙上標(biāo)記好樣品在板上的位置。
2．在A1、A2、A3孔內(nèi)各加100ul陰性對(duì)照（ 1:2 稀釋）。
3．在A4、A5孔內(nèi)加入100ul陽性對(duì)照（1:2 稀釋）。
4．加100ul已稀釋的樣品（1：2）加到相應(yīng)的孔內(nèi)。
5．于室溫放置1小時(shí)或者于2-7℃過夜。
6．傾去孔內(nèi)液體到廢液缸內(nèi)。
7．每孔用近300ul的洗滌液洗3-5次，每次3-5分鐘。每次洗后傾去孔內(nèi)的液體，在洗滌的過程中應(yīng)避免孔內(nèi)干燥，最后一次洗滌后應(yīng)在吸水材料上拍干酶標(biāo)板。
10．
在每一孔內(nèi)加入100ul抗PRV- gE的酶標(biāo)抗體。
11．
室溫放置20分鐘。
10．重復(fù)步驟6和7。
17．在每一孔內(nèi)加入TMB底物溶液100ul。
18．室溫顯色15分鐘。
19．每一孔內(nèi)加入100ul終止劑以終止反應(yīng)。
20．
對(duì)空調(diào)零。
21．在650nm測(cè)量并記錄樣品和對(duì)照的吸收值。
22．計(jì)算結(jié)果。
五、結(jié)果
陽性對(duì)照的平均值（PCX）與陰性對(duì)照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于0.3時(shí)試驗(yàn)方成立。
如果試驗(yàn)不成立，可能操作有誤，試驗(yàn)應(yīng)在熟悉產(chǎn)品說明書后重試。
每一樣品內(nèi)針對(duì)PRV-gE抗體的有無是由樣品與陰性對(duì)照的比率（S/N）來確定。
六、結(jié)果的說明
3．S/N比值小于或等于0.60的樣品確定為PRV-gE抗體陽性。
4．S/ N比值小于或等于 0.7但是大于0. 6的樣品應(yīng)該重新檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果還是如此，則應(yīng)跟蹤該動(dòng)物，過一段時(shí)間之后再進(jìn)行檢測(cè)。
5．如果S/N 值大于0.7，則該樣品中沒有抗PRV-gE的抗體，呈陰性反應(yīng)。
注意：為了確證，所有的陽性樣品都需要做重復(fù)。
七、計(jì)算
4．
陰性對(duì)照平均值（NCX）的計(jì)算

A1A（650）+A2A（650）+A3A（650）
NCX= ——————————————————

3

5．
陽性對(duì)照平均值（PCX）的計(jì)算
A4A（650）+A5A（650）
NCX= ————————————

2


6．
S/N比值的計(jì)算

Sample A（650）
S/N= ————————

NCX