豬病實驗室常規(guī)診斷技術之十二、豬細小病毒檢測方法

nnii521 · 發(fā)表于 2009-6-24 21:19:22

十二、豬細小病毒檢測方法

豬細小病毒血凝抑制試驗操作方法
（一）材料準備
1．抗原：豬細小病毒濃縮抗原
2．PPV陽性及陰性血清
3．被檢血清：自被檢豬的前腔靜脈血或自耳靜脈采血分離血清。

4．紅細胞：按抗凝劑與血液1：4的比例心臟采集豚鼠血液，用PBS洗三次，沉積紅細胞配成0.5%懸液備。

5．稀釋液：用滅菌的PH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）。

6．25%白陶土：取白陶土25克，置離心瓶中，加入適量1mol/L鹽酸溶液，充分攪勻，2 000轉/分鐘離心10分鐘，棄上清，再加1mol/L鹽酸溶液，攪勻，離心，反復洗三次，沉淀白陶土，用0.15mol/L生理鹽水100毫升配成25%懸液，然后用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.2左右,高壓滅菌,置4℃備用,保存期不超過半年。

7．器材：96孔U型滴定板或V型滴定板，25微升稀釋棒，25微升滴管，微量振蕩器，普通離心機。
（一）
試驗操作

HA：用滴管在滴定板上從第一孔至試驗所需稀釋倍數(shù)孔，每孔滴加稀釋液25微升于第一孔再滴加抗原25微升，用稀釋棒從第一孔開始依次稀釋。置微量振蕩器上振蕩15秒，最后每孔滴加0.5%豚鼠紅細胞25微升，振蕩30分鐘，置室1小時判定并記錄結果。

HI：用滴管在滴定板上從第一孔至所需稀釋倍數(shù)孔各加稀釋液25微升，于第一孔滴加被檢測血清25微升，然后每孔加4單位抗原25微升，振蕩15秒，置4℃13小時或室溫4小時，每孔加0.5%的豚鼠紅細胞懸液25微升，振蕩30秒，置室溫1小時判定結果。以完全抑制的最高稀釋倍數(shù)做為HI價。同時設已知陽性血清、已知陰性血清、不加抗原的被檢血清及抗原、紅細胞對照。抗原對照亦即第二滴定，復核使用單位。
（二）
判定標準及注意事項
1．
判定時先檢查對照是否正確，唯有對照各孔準確方可證明操作和使用材料無誤。
2．
紅細胞凝集現(xiàn)象的判定
（1）紅細胞均勻的平均鋪于孔底者可判為“++++”。
（2）基本上與（1）相同，但邊緣有下滑皺縮者為“+++”。
（3）紅細胞于孔底形成環(huán)狀或成團，四周有小凝集塊者為“++”。
（4）紅細胞于孔底形成團塊，但邊緣不整齊或有少量小塊者為“+”。
（5）紅細胞于孔底形成小團塊，邊緣整齊光滑，稀釋液清亮者為“—”。
“++”以上凝集的最高稀釋倍數(shù)做為HA價。

3．凝集抑制：本試驗紅細胞集中于孔底呈團塊狀，邊緣光滑整齊為陽性，以“—”表示，說明抗原凝集紅細胞的特性已被抑制，反之紅細胞呈“++”以上凝集現(xiàn)象者判為陰性。
1．凝集抑制價：以被檢血清最大稀釋倍數(shù)能抑制紅細胞凝集者為該血清抑制價。

(吳
斌)

豬細小病毒病乳膠凝集試驗（LAT）操作方法

豬細小病毒乳膠凝集試驗是用豬細小病毒培養(yǎng)液致敏乳膠抗原來檢測動物血清中的抗體。其具有簡便、快速、特異、敏感之優(yōu)點。
（一）
試驗材料
豬細小病毒病乳膠凝集試驗抗體檢測試劑盒：包括豬細小病毒致敏乳膠抗原、陽性血清、陰性血清和稀釋液、玻片、吸頭及使用說明書。由華中農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院研制。
（二）
操作方法

1．定性試驗：取檢測樣品（血清）、陽性血清、陰性血清、稀釋液各一滴，分置于玻片上，各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1~2分鐘，于3~5分鐘內(nèi)觀察結果。

2．定量試驗：先將血清作連續(xù)稀釋，各取1滴依次滴加于乳膠凝集反應板上，另設對照同上，隨后再各加乳膠抗原一滴，如上攪拌并搖動，判定。
（三）結果判定

1．判定標準：

“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；

“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；

“++”約50％乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁；

“+”有少許凝集，液體呈混濁：

“—”液滴呈原有的均勻乳狀。

2．對照試驗出現(xiàn)如下結果試驗方可成立，否則應重試：陽性血清加抗原呈“++++”；陰性血清加抗原呈“—” ；抗原加稀釋液呈“—”。
以出現(xiàn)“++”以上凝集者判為陽性凝集。
（四）注意事項

1．試劑在2~8℃冷暗處保存，暫定1年。

2．乳膠抗原在使用前應輕輕搖勻。

(吳
斌)

聚合酶鏈式反應（PCR）檢測豬細小病毒

1 材料準備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K，十二烷基磺酸鈉（SDS），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、TEN緩沖液。

引物：擴增豬細小病毒VP2基因中445bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列為,
上游引物P1:
5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’

下游引物P2:
5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3’

儀器設備有：凝膠電泳紫外線檢測儀， PCR擴增儀，電泳儀
2操作步驟：
2.1 樣品的采集：采集病豬的淋巴結、肝臟置-20℃保存。
2.2 樣品處理 所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70℃反復凍融3次，7000r/min離心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl雙蒸水溶解，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/font>
2.3.
PCR的操作程序
PCR反應體系為：總體積50μl，含有100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物， 0.5U Taq酶及1μl模板DNA，常用的反應體系組成如下：

10×緩沖液
5.0 μl

25mM MgCl2
5.0 μl

dNTPs
1.0 μl

引物
各1.0μl

Taq聚合酶
0.5μl

DNA模板
1.0μl

滅菌去離子水
35.50μl

擴増條件為:94℃變性3分鐘，進入循環(huán)，94℃45秒，54℃45秒，72℃30秒，30個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。
2.4
PCR產(chǎn)物的檢測

PCR擴增產(chǎn)物在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結果，并與標準分子量比較，可見一條445bp的DNA片段。