抗流感病毒藥物的分類及研究展望

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　　中國養(yǎng)殖網(wǎng) 2006-9-2 10:18:49 獸藥市場指南   
　　流感是由A型流感病毒引起的禽類急性傳染病，其臨床癥狀從低致病力的無癥狀到中等致病力的呼吸道癥狀，直至高致病力引起的烈性死亡。由于流感病毒的抗原變異能力強(qiáng)，加之個體免疫力不同，疫苗只對已知的流感病毒亞型有預(yù)防作用，而對于由于抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)換所產(chǎn)生的新型流感病毒無效。因此，抗流感病毒藥物研究顯得更加重要和緊迫。

　　目前，正式上市的抗流感藥物大體分為兩類：一是以20世紀(jì)60年代中期發(fā)現(xiàn)的以金剛烷胺（amantadine）為代表的抗流感藥物，只對甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用，屬離子通道阻斷劑；二是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對甲型和乙型流感病毒均有效。另外，以流感病毒反證法復(fù)制過程的不同環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)，還有一些藥物正處于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床實(shí)驗(yàn)階段。

一、離子通道阻斷劑
　　此類藥物以流感病毒基質(zhì)蛋白－2為作用靶點(diǎn)，通過阻斷H＋通道來抑制流感病毒復(fù)制，所以被稱為離子通道阻斷劑，包括金剛烷胺和金剛乙胺（Rimantadine）?；|(zhì)蛋白－2是流感病毒包膜上的一個跨膜蛋白，具有H＋通道活性。它是一個由97個氨基酸殘基組成的同源四聚體，其結(jié)構(gòu)分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)3部分。其中跨膜區(qū)由4個幾乎完全一致的a螺旋組成H＋通道，病毒包膜的低電解質(zhì)環(huán)境迫使a螺旋間的氫鍵具有相同的幾何構(gòu)象，從而最大限度地降低了親水肽在膜外的暴露。特定的條件使得基質(zhì)蛋白－2被充分地限制在病毒包膜中，同時保持了良好的結(jié)構(gòu)與功能。實(shí)驗(yàn)證明，流感病毒基質(zhì)蛋白－2在病毒脫衣殼成熟過程中起重要作用。流感病毒感染細(xì)胞早期，病毒吸附到細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白受體上，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，形成核內(nèi)體（Endosome）。此時，基質(zhì)蛋白－2被激活并打開，H十進(jìn)入病毒使PH降低，核內(nèi)體的酸化引起HA構(gòu)象變化，介導(dǎo)病毒包膜與核內(nèi)體膜融合。同時，病毒顆粒內(nèi)也發(fā)生酸化，導(dǎo)致病毒核衣殼與基質(zhì)蛋白－1之間解離，為病毒基因組進(jìn)入感染細(xì)胞核提供必要條件。在病毒感染細(xì)胞晚期，基質(zhì)蛋白－2的H十通道活性可以升高高爾基復(fù)合體內(nèi)的H十濃度，使流感病毒膜蛋白HA形成高pH構(gòu)象，從而使新生的病毒具有感染性。

　　離子通道阻斷劑金剛烷胺（1966年上市）及其衍生物金剛乙胺（1987年上市）有抗流感病毒作用。金剛烷胺能夠與質(zhì)子結(jié)合基質(zhì)蛋白－2，結(jié)合部位在距離脂質(zhì)雙層膜中心0.5 毫米處的Va127和Ser31中間的特定區(qū)域內(nèi)，從而影響基質(zhì)蛋白－2的活性，阻斷H十通道，抑制流感病毒的復(fù)制，發(fā)揮預(yù)防和治療作用。

　　金剛烷胺和金剛乙胺已在臨床應(yīng)用多年。Jefferson等通過多渠道對這些臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)和資料進(jìn)行了系統(tǒng)的收集、整理和統(tǒng)計，并對這兩種藥物的有效性和安全性進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，金剛烷胺對流感樣疾病（influenza－like illness, ILI）和甲型流感的保護(hù)率分別為25%和61%，并且能夠使發(fā)熱持續(xù)時間減少1天。金剛乙胺有類似的療效，但其預(yù)防作用與安慰劑或其它方法相比并無顯著性差異。同時，研究結(jié)果顯示，金剛烷胺和金剛乙胺均可引起明顯的胃腸道不良反應(yīng)；金剛烷胺和金剛乙胺相比，產(chǎn)生中樞神經(jīng)毒副作用更為常見。另外，此類藥物容易產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥，這與基質(zhì)蛋白－2基因序列中單個核苷酸發(fā)生突變有關(guān)。臨床試驗(yàn)表明，應(yīng)用金剛烷胺后基質(zhì)蛋白－2跨膜區(qū)中的4個氨基酸位點(diǎn)26、27、30和31最易發(fā)生突變。并且，不同病毒亞型突變位點(diǎn)與頻率不同，H3N2亞型常在31位發(fā)生突變（絲氨酸－天冬氨酸），而H1N1亞型則在27位發(fā)生突變（纈氨酸一丙氨酸）；前者的突變頻率高于后者。最近，Astrahan等發(fā)現(xiàn)流感病毒可以通過增大離子通道口徑，使藥物雖然能夠與基質(zhì)蛋白－2結(jié)合卻不能完全封閉離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而產(chǎn)生耐藥性。所以，農(nóng)業(yè)部560號公告已將金剛烷胺和金剛乙胺列入廢止目錄。(編者注)
二、神經(jīng)氨酸酶（NA）抑制劑
　　神經(jīng)氨酸酶是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，由4個亞基組成四聚體。主要結(jié)構(gòu)包括胞漿尾部、跨膜區(qū)、桿部和球狀頭部4部分。其中頭部具有水解酶活性，可水解感染細(xì)胞表面糖蛋白末端的神經(jīng)氨酸與相鄰糖基的α一糖苷鍵，切除病毒表面和感染細(xì)胞表面的唾液酸，一方面破壞了細(xì)胞膜上的病毒特異性受體，使病毒從感染細(xì)胞膜上釋放；另一方面可以防止新生病毒的自身凝集，容許病毒擴(kuò)散并增強(qiáng)其感染能力。此外，神經(jīng)氨酸酶還可以促進(jìn)病毒從呼吸道粘液向周圍組織擴(kuò)散。

　　神經(jīng)氨酸酶在流感病毒復(fù)制和傳播中發(fā)揮重要作用，并且其活性中心的氨基酸組成高度保守，因此，以神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)開發(fā)選擇性抑制劑具有非常重要的意義。
　　最初設(shè)計的Neu5Ac2en是神經(jīng)氨酸的脫水衍生物，它從分子構(gòu)象上模擬了NA催化反應(yīng)過程中的作用物過渡態(tài)，因此，可以與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合并抑制其酶活性。后來，為了增強(qiáng)Neu5Ac2en和酶活性中心的相互作用，研究人員對Neu5Ac2en的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造：首先以胍基取代4位碳原子上的羥基，得到扎那米韋（Zanamivir，GG167，Relenza）；然后應(yīng)用一個環(huán)己烷及用親脂性側(cè)鏈取代極性丙三醇，得到奧塞米韋（Oseltamivir, GS4104，Tamiflu）。目前，扎那米韋和奧塞米韋是在美國僅有的獲批準(zhǔn)上市的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。另外，帶有一個胍基基團(tuán)和親脂性側(cè)鏈的環(huán)戊烷衍生物RWJ270201（BCX－1812）正處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。研究發(fā)現(xiàn)它對于扎那米韋和奧塞米韋已產(chǎn)生耐藥性的甲型和乙型流感變異體有抑制作用，有望成為第三個獲準(zhǔn)上市的神經(jīng)氨酸酶抑制。
　　神經(jīng)氨酸酶抑制劑對甲型和乙型流感病毒均有抑制作用。它能夠與病毒的神經(jīng)氨酸酶特異性結(jié)合，阻斷該酶的活性，使病毒不能輕易地從感染細(xì)胞表面釋放，促進(jìn)病毒凝集，阻止病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，從而發(fā)揮抗流感的作用。最近的一些臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，與安慰劑相比，扎那米韋和奧塞米韋可使流感急性癥狀的持續(xù)時間縮短1～2.5天，并發(fā)癥發(fā)生率降低50%～70％，使患者提前1～3天恢復(fù)正?；顒幽芰Α２⑶?，多數(shù)試驗(yàn)顯示，發(fā)病后越早給藥，治療效果越明顯。
　　與離子通道阻斷劑相類似，由于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的廣泛應(yīng)用，使得流感病毒產(chǎn)生一定的耐藥性。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NA和HA均能影響病毒對此類藥物的敏感性。病毒NA主要通過其活性位點(diǎn)中單個氨基酸殘基的改變產(chǎn)生耐藥而HA則通過其受體結(jié)合位點(diǎn)處氨基酸的組成，寡糖鏈的位置和數(shù)量等因素的改變來影響病毒的易感性。由于病毒耐藥機(jī)制的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)條件的限制，對于這方面的研究還有待深入。

三、以血凝素為靶點(diǎn)的抗流感藥物
　　HA是位于流感病毒表面的一個重要糖蛋白，在轉(zhuǎn)錄后首先表達(dá)為無活性的前提HAO，然后經(jīng)過蛋白酶催化水解為兩個活性的多肽亞單位HA1和HA2。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HA1介導(dǎo)病毒與感染細(xì)胞受體上唾液酸之間的吸附作用；HA2引導(dǎo)病毒包膜和核內(nèi)體膜的融合。目前，以HA1和HA2為靶點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些有抗流感病毒活性的化合物。
　　流感病毒吸附抑制劑 已知流感病毒HA1鏈遠(yuǎn)端球狀頭部上的抗原表位可以識別和多價結(jié)合細(xì)胞表面受體上的唾液酸，介導(dǎo)病毒的吸附。唾液酸類似物可以誘使HA1鏈上的受體結(jié)合位點(diǎn)與之結(jié)合，從而干擾或阻斷病毒的吸附作用。研究表明，單價的唾液酸類似物不能有效地與靶細(xì)胞上的多價受體進(jìn)行結(jié)合，因此，為了提高抗病毒作用，通過多種方法設(shè)計合成了二價和多價唾液酸類似物（包括唾液酸糖苷脂質(zhì)體、唾液酸糖苷多聚體和樹突狀唾液酸類似物）。Reuter等對多價唾液酸類似物研究表明，結(jié)構(gòu)和形狀對此類藥物的作用效果有明顯影響。他們對線形、球性和樹突狀等幾種不同形狀的多聚物分別進(jìn)行了抗流感病毒體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，樹突狀唾液酸類似物的作用效果最佳，并且，在治療水平上無細(xì)胞毒性作用。筆者通過制備金絲桃素蛋白復(fù)合物，體內(nèi)外對H5N1及H7N1病毒有較好的抑制作用，其機(jī)理主要是干擾病毒與細(xì)胞的吸附。

　　細(xì)胞一病毒膜融合抑制劑 流感病毒與核內(nèi)體膜發(fā)生融合是病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制的關(guān)鍵步驟。研究表明，流感病毒HA2鏈在核內(nèi)體pH降至5左右時發(fā)生構(gòu)象變化，N端的融合肽暴露并插入核內(nèi)體膜中，引起兩者膜融合。目前文獻(xiàn)報道的流感病毒膜融合抑制劑多數(shù)是通過抑制pH誘導(dǎo)的HA構(gòu)象發(fā)生變化發(fā)揮抗病毒作用，其中代表性藥物是Stachyflin。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，此化合物能夠穩(wěn)定HA在中性pH條件下的構(gòu)象。另外Stachyflin只對流感病毒H1和H2兩個亞型有效，而對H3和B型流感病毒無抑制作用，具有亞型特異性。
四、反義寡核苷酸
　　反義寡核苷酸（ODN）作為一種研究工具，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于特異性抑制基因表達(dá)，并作為潛在的治療藥物在艾滋病、癌癥、流感、單純皰癥以及其他疾病中占有重要的地位。在應(yīng)用ODN對流感病毒基因中的4個不同基因PB1、PB2、PA和NP進(jìn)行抑制的研究發(fā)現(xiàn)：脂質(zhì)體包裹的硫代磷酸脂類反義寡核苷酸（S－ODN）對PB2的起始密碼子AUG有較高的抑制作用，而對PB1的抑制作用相對較弱；脂質(zhì)體包裹的硫代磷酸脂類反義寡核苷酸比自由寡核苷酸顯示了更高的抑制活性和序列特異性。另外，將病毒PB2一AUG和PA－AUG的兩種S－ODN靜脈注射給甲型流感病毒感染的小鼠，結(jié)果顯示，流感病毒PB2－AUG的一段寡核苷酸顯著的延長了小鼠的平均存活時間，提高了存活率，并具有劑量依賴性。這是第一次在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ODN治療流感獲得成功，為ODN在流感治療中應(yīng)用帶來了新的希望。

五、 RNA干擾
　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，并且是一種在進(jìn)化上高度保守的免疫防御機(jī)制。作為抑制流感病毒感染的理想方法主要有以下幾個原因：首先流感病毒為RNA病毒，在病毒的整個生命周期中除mRNA外，病毒顆粒RNA(Virion RNA)和互補(bǔ)RNA (Complementary RNA)均可以作為小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA )作用的靶點(diǎn)；其次由于流感病毒基因組分片段編碼不同的病毒蛋白，每一種蛋白在病毒的生命周期中都發(fā)揮重要作用，因此，可以同時抑制一個或多個病毒基因片段，從而更好地防止耐藥性病毒的產(chǎn)生；再次 siRNA可以通過吸入的方式給藥，不僅使用方便，而且可以增加其在感染部位的藥物濃度。并且，由于感染早期病毒數(shù)量小，充足的siRNA可以更有效地抑制病毒的復(fù)制，從而起預(yù)防和治療的效果；最后RNAi與流感疫苗不同，不需要使用者具有健全的免疫系統(tǒng)，基于上述認(rèn)識，Ge等針對流感病毒的不同基因設(shè)計了20個siRNA，結(jié)果提示，以NP和PA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA對流感病毒有抑制作用。另外，Bertrand等的研究表明，與ODN相比，siRNA的抗流感病毒作用更為有效和持久。

六、結(jié)語
　　目前，抗流感病毒的藥物研究已取得初步成果，已有離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑兩大類四種藥物在國外正式上市，某些藥物正處于臨床階段，有望在未來幾年內(nèi)獲準(zhǔn)在臨床使用。但是，由于現(xiàn)有藥物在臨床上廣泛應(yīng)用，使流感病毒發(fā)生變異，并對這些藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，離子通道阻斷劑存在對B型流感病毒無效和神經(jīng)毒性等缺陷，因此，對現(xiàn)有藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并尋找新藥物作用靶點(diǎn)是今后的主要發(fā)展方向。對流感病毒吸附抑制劑、細(xì)胞一病毒膜融合抑制劑和ODN在這方面做出了有益嘗試，并且在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)了一定的抗病毒活性，能否進(jìn)入臨床，還有待于進(jìn)一步的研究。

zhangguangxin

好像都是西藥方向，中藥在流感方面也有不俗的表現(xiàn)。