飼料中色氨酸測(cè)定方法

nzhqlucky · 發(fā)表于 2009-7-29 17:43:29

分光光度法

【標(biāo)準(zhǔn)名稱】飼料中色氨酸測(cè)定方法分光光度法

【標(biāo)準(zhǔn)號(hào)】 GB/T 15400-94

【標(biāo)準(zhǔn)文件】

飼料中色氨酸測(cè)定方法——分光光度法

（畜禽飼料與添加劑）

1 主題內(nèi)容與適用范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定飼料中色氨酸的原理和方法。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、混合飼料、濃縮飼料和單一飼料。

2 引用標(biāo)準(zhǔn)

GB 6433 飼料粗脂肪測(cè)定方法

3 原理

　　飼料中蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，降解成多肽和游離的氨基酸，在酸性介質(zhì)中，氧化劑存在下，色氨酸吲哚環(huán)與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與色氨酸含量成正比。

4 試劑

　　除注明者外均為分析純。水為蒸餾水。

4.1 硫酸（GB 625）溶液、 c （1/2H 2 SO 4 ）＝21.2mol/L 量取 589mL硫酸徐徐加入約350mL水中，冷卻后用稀釋至1L。

4.2 1％對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液：

1.0g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于21.2mol/L硫酸（4.1）中并定容100mL。

4.3 0.2％亞硝酸鈉（GB 633）溶液（ m / V ）。

4.4 10％氫氧化鉀（GB 2306）溶液（ m / V ）。

4.5 L-色氨酸，色譜純。

4.6 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：

　　準(zhǔn)確稱取 25.0mgL-色氨酸于小燒杯中，加少量0.1mol/L氫氧化鉀溶液使之溶解，定量地轉(zhuǎn)移到250mL棕色容量瓶中，用水定容，濃度為100 μ g/mL。

注：本標(biāo)準(zhǔn)溶液 4℃冰箱中保存，一個(gè)月內(nèi)使用，濃度不變。

5 儀器、設(shè)備

5.1 分析天平：感量0.1mg。

5.2 分光光度計(jì)。

5.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速4000r/min。

5.4 實(shí)驗(yàn)室用粉碎機(jī)。

5.5 培養(yǎng)箱。

5.6 容量瓶：25mL、50mL、250mL。

5.7 10mL具塞試管。

5.8 刻度吸管：0.5mL、2mL、5mL、25mL。

6 試樣的制備

6.1 選取有代表性的試樣，按四分法縮分至200g，粉碎，全部通過(guò)0.25mm孔徑篩（60目）。

6.2 按GB 6433 脫脂并測(cè)定脂肪含量。脫脂樣品風(fēng)干后，混勻，裝入密封容器內(nèi)備用。

7 分析步驟

7.1 工作曲線的繪制

7.1.1 吸取色氨酸濃度為100 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.6）5.00、7.50、10.00、12.50、15.00、17.50mL分別置于25mL棕色容量瓶中用水定容，搖勻。溶液濃度分別為20、30、40、50、60、70 μ g/mL。

7.1.2 吸取各濃度溶液（7.1.1）1mL，分置具塞試管（5.7）中，空白管加1mL水向每支試管內(nèi)加入氫氧化鉀溶液（4.4）1mL，混勻，將試管放入冷水盆中，加5mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），從冷水盆中取出試管，搖勻，在室溫（20～30℃，下同）放置30min。

7.1.3 向上述每支試管內(nèi)加0.2mL亞硝酸鈉溶液（4.3），搖勻，室溫放置25min。

7.1.4 以空白管調(diào)零，在590nm波長(zhǎng)下，以1cm光徑測(cè)定各溶液吸光度值。

7.1.5 以色氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，或列出回歸方程式。

7.2 樣品測(cè)定

7.2.1 稱樣：按附表A建議的稱樣量稱取脫脂試樣兩份，精確至0.1mg。

7.2.2 水解：將試樣置于50mL容量瓶（5.6）中，在輕輕振搖中緩慢加入25mL氫氧化鉀溶液（4.4），使試樣濕潤(rùn)且不粘壁，置于40±1℃培養(yǎng)箱（3.5）中水解16～18h。

7.2.3 離心：取出水解液冷卻至室溫后，用水定容，搖勻，取部分水解液以4000r/min轉(zhuǎn)速離心15min。

7.2.4 顯色：取2mL上清液置具塞試管（5.7）中，并將試管放入冷水盆中，加入5mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），搖勻。每個(gè)試樣另取2mL上清液于具塞試管（5.7）中，加5mL硫酸溶液（4.1）作為樣品空白，搖勻，室溫放置30min。然后向每支試管內(nèi)加入0.2mL亞硝酸鈉溶液（4.3），搖勻，室溫放置25min。

7.2.5 比色：以樣品空白調(diào)零，在590nm波長(zhǎng)處1cm光徑測(cè)定樣品溶液的吸光度值。

8 分析結(jié)果的表述

8.1 計(jì)算公式