水產(chǎn)動物疾病快速診斷技術的發(fā)展與應用

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自改革開放以來，我國漁業(yè)得到了快速發(fā)展，水產(chǎn)品產(chǎn)量連續(xù)十幾年位居世界首位。2008年，我國水產(chǎn)品出口額首次突破100億美元，總額達106億美元，占農(nóng)產(chǎn)品出口總額（405億美元）的26.2%，繼續(xù)位居大宗農(nóng)產(chǎn)品出口首位。然而全國水產(chǎn)技術推廣總站病害監(jiān)測報告指出，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖品種繁多，病害發(fā)生種類、綜合發(fā)病多，發(fā)病時間長，流行面積廣，病害控制難度大，死亡率高，經(jīng)濟損失大。危害我國水產(chǎn)動物的病害主要是細菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲性疾病和真菌性疾病，其中細菌性疾病在各年病害暴發(fā)病例中所占的比例最大，藻類疾病和不明原因的疾病所占比例相對較少。2004-2006年，我國水產(chǎn)動物病害監(jiān)測到的疾病分別有126、207和214種，造成的經(jīng)濟損失分別是151.44、110和115.08億元。
    造成水產(chǎn)動物病害暴發(fā)和流行的因素有很多，然而作者認為，如果養(yǎng)殖業(yè)者在病害暴發(fā)流行的早期便能對病害進行診斷，同時加上各種得當?shù)姆乐未胧?，病害造成的?jīng)濟損失可以降到最低。為了使快速診斷技術在水產(chǎn)動物疾病中得以普及，本文圍繞不同類型的快速診斷技術展開闡述，期望能為水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)人員帶來幫助。
一、簡易快速診斷技術
    1、眼觀快速診斷技術
    簡易眼觀快速診斷技術是一種簡單而易推廣的技術。這種技術既不需要高端儀器，也不需要昂貴的費用，就可實現(xiàn)對常規(guī)疾病的快速診斷，廣受水產(chǎn)養(yǎng)殖一線群眾的推崇。一般情況下，人們往往通過簡單的口述，將水產(chǎn)動物的各種疾病診斷要點進行傳授。這種快速診斷技術僅局限于對常見的、具有特征性癥狀的水產(chǎn)動物疾病的診斷。
    （1）根據(jù)體表癥狀的快速診斷法
    一般情況下，體表充血、發(fā)炎、鱗片脫落則多為赤皮?。蝗舨◆~僅鰓蓋或鰭條基部充血，皮膚充血不明顯，撕開表皮發(fā)現(xiàn)肌肉呈充血狀或塊狀淤血則為出血??；病魚腹部膨大，肛門紅腫呈紫紅色，輕壓腹部有黃色黏液流出則多為腸炎??；尾柄及腹部兩側有火烙樣的紅斑或表皮腐爛呈印章狀則為打印?。惑w表生有棉絮狀的白色物則為水霉??；體表黏液較多并有小米粒大小、形似臭蟲狀的蟲體為鲺?。惑w表有白色亮點，離水兩小時后亮點消失則為小瓜蟲病；體表有白色斑點，白點之間有出血或紅色斑點則為卵甲藻??；部分鱗片處發(fā)炎紅腫，有紅點并伴有針狀蟲體寄生則為錨頭鳋?。霍~苗、魚種成群在池塘周邊或池水表面狂游，且頭部充血呈紅點，死亡多且迅速，一般為車輪蟲?。徊◆~尾柄表皮發(fā)白則為白皮??；病魚在水中頭部或嘴部明顯發(fā)白，離水后又不明顯的為白頭白嘴??；魚下唇突出呈簸箕口狀則可能為池塘中常缺氧浮頭引起的；病魚眼睛突出，且鱗片松立，一般為池塘中有毒所致；魚體呈彎曲狀可能是由于營養(yǎng)不良或有機磷中毒所致，營養(yǎng)不良性疾病屬于慢性疾病，而有機磷中毒則為急性中毒性疾病，生產(chǎn)上根據(jù)經(jīng)驗容易將兩者區(qū)別診斷。
    （2）根據(jù)鰓瓣癥狀的快速診斷法
    打開病魚鰓蓋，檢查鰓有無異樣，正常的鰓絲整齊、緊密、呈鮮紅色。鰓絲腐爛發(fā)白、尖端軟骨外露，并有污泥和黏液，則為爛鰓??；鰓絲因貧血而發(fā)白，很可能是鰓霉病或球蟲??；鰓絲末端掛著像蠅蛆一樣的白色小蟲則為中華鳋?。祸w部浮腫，鰓蓋張開不能閉合，鰓絲失去鮮紅色呈暗淡色則為指環(huán)蟲病；鰓絲呈紫紅色，黏液較少則可能為池塘中缺氧引起泛池所致；鰓絲呈紫紅色，并伴有大量黏液則應考慮是否為中毒性疾病，如過量使用有機氯消毒劑時這種現(xiàn)象較常見。
    （3）根據(jù)腸道癥狀的快速診斷法
    剖開病魚腹部，檢查腸道，正常魚的腸道中充滿食物或糞便，腸壁呈肉紅色。若腸道全部或局部出現(xiàn)充血，腸壁不發(fā)炎者為出血??；充血發(fā)炎且伴有大量黃色黏液則為腸炎?。磺澳c段腫大，但腸道顏色外觀正常，腸內(nèi)壁含有許多白色絮狀物小結節(jié)則為球蟲病或粘孢子蟲病。
    2、顯微鏡檢快速診斷技術
    簡易顯微鏡快速診斷法，即應用普通顯微鏡對水產(chǎn)動物進行疾病的檢查和診斷。這種方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)第一線的應用最為廣泛，是根據(jù)目檢時所確定下來的病變部位，作進一步的診斷，常用于對病魚的體表、鰓、腸道、眼、腦等部位常見的寄生蟲性病原進行快速診斷。其主要判斷依據(jù)是蟲體的形態(tài)特征和蟲體寄生部位。
    （1）體表快速鏡檢法
    在發(fā)病魚體表疑似病變部位上取適量組織和黏液均勻涂布于載玻片上，再滴加一滴無菌生理鹽水，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察，原則是先以低倍鏡觀察，再以高倍鏡觀察。體表常見的寄生蟲種類主要有車輪蟲、小瓜蟲、斜管蟲、魚波豆蟲、鉤介幼蟲、粘孢子蟲等。體表鏡檢時，一般每個部位至少檢查兩個不同疑似位點。
    （2）鰓絲快速鏡檢法
鰓絲常見的寄生蟲主要有指環(huán)蟲、三代蟲、隱鞭蟲、粘孢子蟲等。診斷時，用鑷子取一小部分鰓絲和黏液置于載玻片上，然后進行顯微鏡下診斷。
    （3）腸道快速鏡檢法
    腸道常見的寄生蟲主要為毛細線蟲、艾美蟲、粘孢子蟲等，診斷時，用鑷子取適量前腸壁黏液置于載玻片上，然后進行顯微鏡下診斷。
    （4）眼部快速鏡檢法
    如果發(fā)現(xiàn)發(fā)病魚的眼睛渾濁，晶狀體模糊時，可將病魚整個眼球晶狀體取下，置于載玻片上鏡檢。如果見到雙穴吸蟲囊蚴則可定為雙穴吸蟲病。
    （5）腦部快速鏡檢法
    如果發(fā)現(xiàn)魚發(fā)生瘋狂病（可根據(jù)經(jīng)驗判斷），可將病魚腦腔剖開，仔細觀察在腦旁擬淋巴液處是否有白色的粘孢子蟲孢囊。若有，可用鑷子將孢囊取出置于載玻片上壓碎，顯微鏡下檢查時可以見到許多孢子，即可確診。
二、選擇性培養(yǎng)基（Selective medium）快速診斷技術
    利用不同的培養(yǎng)基特定成分和培養(yǎng)條件，以抑制多數(shù)細菌，而只利于某一種或某一類細菌生長的培養(yǎng)基，即為選擇性培養(yǎng)基。選擇性培養(yǎng)基配制容易，使用方便，可作為基層實驗室日常診斷的方法之一。選擇性培養(yǎng)基具有操作簡單、結果可靠等優(yōu)點，一般情況下，24-48h內(nèi)即可得出診斷結果，然而該系列方法僅局限于對細菌性病原的選擇性診斷，不適用于對寄生蟲性和病毒性病原的診斷。
    1、 Rimler-Shotts培養(yǎng)基
    Rimler-Shotts培養(yǎng)基用于鑒別腐皮病病原嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。從病魚病灶、肝、腎等內(nèi)臟分離病原菌，接種于Rimler-Shotts培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)20-24h后，如菌落為黃色，則病原為嗜水氣單胞菌。其它顏色，如綠色、黃綠色、黃色菌落中央有黑點等，則是其它細菌。使用選擇性培養(yǎng)基時，培養(yǎng)溫度和時間很重要，如殺鮭氣單胞菌在培養(yǎng)溫度低于37℃ 時，產(chǎn)生的菌落特征與嗜水氣單胞菌相似。1973年，Shorts和Rimler用Rimler-Shotts培養(yǎng)基，從水產(chǎn)動物和水體分離的109個菌株中進行嗜水氣單胞菌鑒定，其結果準確率達94％。
    2、EIM培養(yǎng)基（Edwarsiella ictaluri medium）
    EIM培養(yǎng)基是專門用于分離和鑒別一種嚴重危害斑點叉尾魚回的腸桿菌——魚回愛德華氏菌，它能抑制多數(shù)魚類病原菌和真菌的生長。在25℃培養(yǎng)48h后，E.ictaluri菌落呈綠色、半透明、直徑大小為0.5-1.0mm；而若菌落呈褐色、褐綠色、紅色、黃綠色，且直徑大于2mm的，則為其它細菌。因此根據(jù)菌落的顏色及菌落大小可實現(xiàn)快速診斷。
    3、優(yōu)化的Shieh 培養(yǎng)基
    Decostere 等人發(fā)現(xiàn)，妥布霉素對柱狀黃桿菌具有較少的抑制作用，而對其它魚類病原菌則有較強的抑制作用。因此，他通過在Shieh培養(yǎng)中添加妥布霉素（1µg/mL），配制了對柱狀黃桿菌生長具有選擇性的優(yōu)化培養(yǎng)基。將分離的病原接種于優(yōu)化的Shieh 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h后，柱狀黃桿菌能在培養(yǎng)基上生長，而其他細菌則幾乎不能生長，因此該優(yōu)化的培養(yǎng)基可用于對柱狀黃桿菌的選擇性快速診斷。
三、免疫學快速診斷技術
    免疫學快速診斷技術是一項特異、敏感和簡便的技術，廣泛應用于許多領域，尤其在生物醫(yī)學的理論研究和臨床診斷方面更是發(fā)揮了不可替代的作用。其主要包括血清凝集試驗，免疫熒光抗體和免疫酶標技術在水產(chǎn)動物疾病診斷上的應用具有靈敏度高、特異性強、定位準確和應用廣泛等優(yōu)點。
    1、凝集試驗
    （1）血清凝集試驗
    顆粒性抗原與相應抗體在適當條件下發(fā)生反應，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊，稱為直接凝集反應。將已知的抗體直接與待檢的顆粒性抗原物質（如細菌、立克次體、鉤端螺旋體、紅細胞等）混合，在有適當電解質存在的條件下，如兩者對應便發(fā)生特異性結合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對應無凝集物出現(xiàn)，即為陰性。血清凝集試驗屬定性試驗。其操作過程如下：取潔凈載玻片一張，用移液器取標準陽性診斷血清10µl，滴加于載玻片的一端，另端則滴加生理鹽水10µl，做對照。然后用鉑耳環(huán)釣取少許待檢細菌，置生理鹽水滴中緩慢混勻，再將鉑耳環(huán)滅菌后冷卻，釣取少許待檢細菌置于血清滴中緩慢混勻。在3-5min內(nèi)，血清滴若出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该?，鹽水對照滴仍均勻混濁，凝集反應結果為陽性，說明待檢細菌為陽性。該方法操作簡單、診斷快速、結果可靠，適用于有條件制備陽性血清的實驗室或已經(jīng)標準陽性血清的單位使用。
    （2）血凝試驗和血凝抑制試驗
    何福林等（2002）指出，草魚出血病病毒具有凝集雞紅細胞的能力，特異性抗血清能有效地阻擋此種凝集, 血凝試驗和血凝抑制試驗兩種試驗結合應用，能對草魚出血病病毒和相應抗體進行定性與定量檢測，試驗要求的溫度、酸堿度、紅細胞種類等條件較易操作，各毒株間的血凝特性無明顯差別，加之試驗操作簡便、反應快速、特異，尤其是對醛化紅細胞具有很強的凝集能力，能快速診斷草魚出血病。
    2、免疫熒光抗體技術
    免疫熒光抗體技術以熒光素為標記物，與已知抗體結合作為標準試劑，用于檢測未知抗原，可在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復合物及其存在部位。這項技術將免疫反應的特異性、靈敏性與顯微鏡技術的精確性相結合，是現(xiàn)代標記免疫檢測的重要方法之一。殷戰(zhàn)等（1994）應用此技術觀察感染鰱魚組織中的病原菌。夏春等（1998）制作了６種兔抗中國淡水魚主要病原菌的純化抗體，用免疫熒光抗體法與各病原菌以及來源于水環(huán)境和魚體分離菌發(fā)生反應，表明此法能用于檢測中國魚類病原菌的并發(fā)、繼發(fā)和混合性感染。王軍等（2002）建立了大黃魚病原溶藻弧菌的免疫熒光抗體檢測方法，用于已感染發(fā)病或已感染未發(fā)病大黃魚的快速檢測。徐宋娟等（2004）應用免疫熒光抗體技術（IFAT）和標記鏈親和素-生物素（LSAB）免疫組化法對患淋巴囊腫病牙鲆的10種組織進行了檢測，發(fā)現(xiàn)體表有囊腫癥狀病魚的胃、腸、鰓和表皮組織內(nèi)有淋巴囊腫病毒存在；體表未見囊腫癥狀病魚的胃、腸和表皮組織內(nèi)也檢測到了病毒，說明此免疫技術可以應用于牙鲆淋巴囊腫病的檢測與診斷。張利峰等（2008）用制備的SVCV單抗，運用間接免疫熒光抗體技術（IFAT）對SVCV歐洲株和亞洲株感染的鯉魚上皮瘤細胞進行檢測，結果表明，應用該單抗可以檢測出SVCV的歐洲株或亞洲株，不會造成漏檢現(xiàn)象。而目前間接免疫熒光（IFAT）這兩種快速診斷SVCV的方法已基本上解決了SVCV快速檢測的基本要求。
    3、免疫酶標技術
    免疫酶標技術是利用抗原-抗體反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性，達到在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的部位的目的。其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗是免疫酶標技術中最具特異性、敏感性、結果易于檢測等特點的一種方法，近年來被廣泛用于水產(chǎn)動物疾病的診斷。葉雪平等（1989）應用此法檢測出草魚出血病病毒抗原。江育林等（1990）檢測了虹鱒的傳染性胰臟壞死病病毒。Snow（1999）等建立出血性敗血癥病毒（VHSV）的ELISA檢測方法，用來檢測感染的大菱鲆，實驗結果對于大菱鲆的HVSV感染的防治有重要的參考價值。王軍等（2001）建立了網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚病原菌－副溶血弧菌酶聯(lián)免疫吸附法。楊鳶劼等（2005）制備了鰻弧菌B-11菌株的兔抗血清，并應用間接酶聯(lián)免疫吸附法能檢出1.5×10 -5個/m1濃度的B-11菌株，對患病魚體的組織培養(yǎng)物鰻弧菌進行檢測，呈現(xiàn)出明顯的陽性反應，將此方法進行改良制備成商品試劑盒可對鰻弧菌進行快速，準確診斷，同時試劑盒的開發(fā)也具良好的應用前景。
四、分子生物學快速診斷技術
    隨著分子生物學技術在水產(chǎn)領域的廣泛應用，分子生物學技術已經(jīng)體現(xiàn)出極高的應用價值和經(jīng)濟價值。它對解決水產(chǎn)業(yè)的技術難題、開創(chuàng)新的領域、改造產(chǎn)業(yè)的傳統(tǒng)模式起著十分重要的作用。包括我國在內(nèi)的許多國家都在大力研發(fā)與水產(chǎn)業(yè)有關的分子生物學技術，并著力于開發(fā)新的優(yōu)良養(yǎng)殖種類、培育高產(chǎn)抗逆的良種以及探尋檢測和防治病害的新技術、新方法等。因此應用分子生物學技術進行水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的疾病診斷領域具有強大的發(fā)展?jié)摿Α?br />     1、單克隆抗體技術
    單克隆抗體是由一個抗體產(chǎn)生的細胞與一個骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞，經(jīng)無性繁殖而來的細胞群產(chǎn)生。它與常規(guī)血清抗體相比，具有特異性強、親和性一致、能識別單一抗原決定簇、且容易制備等特點，已成為生物工程學的重要組成部分。Arkush等（1992）制備7種斑點叉尾魚回病毒CA8O一5株的單克隆抗體，采用中和試驗及直接熒光抗體等方法，發(fā)現(xiàn)了CA8O-5株與其它幾株的抗原性差別。黃健等（1995）應用單克隆抗體酶聯(lián)免疫技術檢測對蝦皮下及造血組織壞死病的病原及其傳播途徑。戰(zhàn)文斌等（1999）應用單克隆抗體的熒光抗體方法觀察白斑病毒在日本對蝦體內(nèi)的感染增殖。王亮等（2004）成功獲l8株抗牙鲆淋巴囊腫病毒的單克隆抗體，并通過保持細胞系重復獲得相同的抗體。而今，單克隆抗體技術已在水產(chǎn)動物病原體檢測中得到了廣泛應用，如應用于診斷海灣扇貝的鰓立克次體、魚類及牡蚜相結合的淋巴細胞病毒、鮭鱒紅嘴病及癤瘡病、鰻弧菌、斑點叉尾魚回病毒、魚病毒性出血敗血病毒、嗜水氣單胞菌敗血癥等。
    2、PCR技術
    PCR技術又稱DNA體外擴增技術，它是利用體外酶促反應合成特異DNA片段的一種方法，典型的PCR由高溫變性模板，引物與模板退火，引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。PCR診斷技術可以應用于對細菌性病原、病毒性病原、寄生蟲性病原等的快速診斷，其關鍵在于特異性引物的設計。梁萬文等（2007）根據(jù)NCBI公布的魚回愛德華氏細菌序列, 設計了一對特異性診斷引物CM3/CM4, 對魚回愛德華氏細菌特異基因片段進行PCR擴增試驗, 擴增到與預計大小相符的276bp愛德華氏菌特異性片段, 可以檢測出病魚腦、肝、腎及脾中的病原菌。余曉麗等（2008）根據(jù)嗜水氣單胞菌16Sr RNA 基因序列, 設計并合成一對特異性引物, 用PCR 方法對從病死鰱魚體內(nèi)分離到的一 株嗜水氣單胞菌進行擴增。該引物能擴增出680bp 的嗜水氣單胞菌特異基因片段，特異性好，最低檢測量為10pg 嗜水氣單胞菌基因總DNA，可用于鰱魚嗜水氣單胞菌的快速診斷, 對有效治療和控制魚類嗜水氣單胞菌病的流行具有重要意義。林端等（2007）報道，由國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心和國家海洋局第三海洋研究所自主研制開發(fā)的魚類虹彩病毒PCR快速檢測試劑盒，特異性高,與其他常見水生生物病毒無交叉反應。該檢測試劑盒的最低檢測限度為30個病毒粒子,其靈敏度優(yōu)于國內(nèi)外其它魚類虹彩病毒檢測方法，適用于多魚種虹彩病毒病的早期快速診斷、苗種檢疫以及水質環(huán)境的監(jiān)測。而史成銀（2008）依據(jù)大菱鲆紅體病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus, TRBIV）主要衣殼蛋白基因序列設計了PCR引物，建立了TRBIV 的PCR 檢測方法。
    3、核酸原位雜交技術
    核酸原位雜交技術是在一定生物結構基礎之上的核酸雜交，可反應基因雜交的準確部位，即可檢測出特定基因的準確位置。常青山等（2000）以海捕中國對蝦為材料，利用PCR技術和核酸探針技術，對從中國對蝦桿狀病毒核酸隨機文庫中篩選的４個片段，用地高辛標記作為探針，進行斑點雜交，檢測對蝦桿狀病毒。Martha等（2001）以從患TS（Taura Syndrome）病毒的病蝦上分離的TSV的cDNA為探針進行原位雜交以檢測TSV病毒的存在。
    4、16S rRNA技術
    16S rRNA是核糖體RNA的一種，具有分子量適中、所含的遺傳信息豐富等特點。在結構上分為保守區(qū)（Conserved domain）和可變區(qū)（Variable domain）。保守區(qū)能反映生物物種的親緣關系，可變區(qū)能揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標。目前16S rRNA序列分析已廣泛用于水產(chǎn)動物病原菌的鑒定。Ragnhild等（1995）通過對分離于大西洋鮭魚、虹鱒魚、大菱鲆和鱈魚中的致病弧菌的16S rRNA序列進行比對，對魚類致病弧菌進行分類。Carlos等（1999）通過對26株不同來源的魚病菌的16S rRNA基因序列的分析，確定了魚出血性敗血病血癥病原美人魚發(fā)光桿菌的分類地位，并建立了基于16S rRNA基因的巢式PCR病原檢測方法。Cerda等（2001）利用一種特異的16SrRNA基因探針對V.vulnificus 病毒進行檢測。鄒玉霞等（2004）通過對大菱鲆出血癥病原菌的16S rRNA 基因進行系統(tǒng)發(fā)育學分析，確定了該病原菌為鰻弧菌。耿毅等（2006）從發(fā)生急性流行性傳染病的斑點叉尾魚回肝臟、腎臟分離到一高致病性的菌株，經(jīng)16S rRNA序列分析，鑒定其為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。
五、結語
    近半個世紀以來，隨著水產(chǎn)動物疾病研究廣泛地與其它先進技術手段相結合，尤其與分子生物學技術的結合，為水產(chǎn)動物疾病快速診斷技術的研發(fā)帶來了福音。快速準確的病原體檢測手段，高效免疫疫苗的制備都在很大程度上緩解了病害所帶來的嚴重損失。然而目前許多快速診斷技術都處實驗室研究階段，將這些快診技術應用于生產(chǎn)，還有待于條件方法的優(yōu)化以及儀器設備成本的降低。隨著研究的深化，水產(chǎn)動物疾病的快速診斷技術也在不斷向前發(fā)展，基因芯片（又稱DNA芯片）技術的研發(fā)也漸有突破。日本水產(chǎn)綜合研究中心已經(jīng)成功開發(fā)出利用DNA晶片快速診斷魚類細菌性疾病的新技術，利用DNA晶片的診斷法與過去只能檢出特定病原菌的PCR法或培養(yǎng)法相比，不但在檢察時間或步驟上縮短許多，在成本上也比較便宜。利用該技術，以往被歸為不明原因的細菌性疾病也能在一次的診斷中檢測出來。應用基因芯片技術快速診斷技術確實是一種敏感性強、精確度高的有效檢測手段。

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