大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

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大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

一、基本原理
1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation）：將外源DNA導(dǎo)入受體菌株使其由于捕獲了來(lái)自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。
2、感受態(tài)細(xì)胞：由于外源DNA本身不具備感染細(xì)胞的能力，為了使細(xì)胞能吸收外源DNA，就必須通過(guò)物理或化學(xué)處理改變受體細(xì)胞的生理狀態(tài)（細(xì)胞膜的通透性），使之具有很高的接受外源DNA的能力，這種經(jīng)歷了處理的具有接受外源DNA能力的細(xì)胞叫做感受態(tài)細(xì)胞。
二、大腸桿菌作為基因工程宿主菌的優(yōu)越性和局限性
1、優(yōu)越性：
（1）大腸桿菌是迄今為止研究得最詳盡的原核生物
（2）已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各種宿主菌和載體
（3）培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)
（4）實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因，如生長(zhǎng)激素基因和胰島素基因等，都可在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)
2、局限性：
（1）不具備真核生物的蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)
（2）缺乏真核生物蛋白質(zhì)加工修飾系統(tǒng)
（3）內(nèi)源蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定
（4）細(xì)胞膜間隙含有大量?jī)?nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)
三、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法
1、CaCl2法
（1）CaCl2法是制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞最常用的化學(xué)方法。
（2）優(yōu)點(diǎn)：易操作，費(fèi)用低，無(wú)需特殊設(shè)備。缺點(diǎn)：所制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低。
（3）原理：將快速生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，易與外源DNA黏附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。此時(shí)，42℃熱激，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。
（4）技術(shù)要點(diǎn)：使菌體始終保持低溫狀態(tài)；為防止污染，要在超凈臺(tái)上操作；所有容器都要高溫高壓滅菌并預(yù)冷；操作既要謹(jǐn)慎，又要迅速。
（5）改良Hanahan法：此法是在CaCl2法基礎(chǔ)上發(fā)展而成，轉(zhuǎn)化率是普通CaCl2法的10～100倍。主要是緩沖液的改良（TB buffer），其中使用二甲基亞砜（DMSO）和二巰基蘇糖醇（DTT）。
2、電擊法：
（1）電擊法制備的感受態(tài)細(xì)胞比CaCl2法穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化率高100～1000倍，但費(fèi)用較高。需要電轉(zhuǎn)化儀。
（2）原理：利用瞬間高壓使細(xì)胞膜產(chǎn)生小孔而接受外源DNA。
（3）步驟：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli菌液冷卻至4℃離心，用相同溫度的純水洗滌，用10％的甘油懸浮后將高密度菌液置于特制的電極杯中進(jìn)行電擊。
（4）技術(shù)要點(diǎn)：低溫操作；注意污染；操作中需要將DNA溶液中的鹽分全部去掉，否則因鹽分而產(chǎn)生高電流，高電流產(chǎn)生火花而殺死E.coli。脫鹽一般采用乙醇沉淀DNA的方法。

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