大腸桿菌的獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法步驟

wangqiaomei

各位同仁：我現(xiàn)要做大腸桿菌的分離培養(yǎng)，具體該如何做？以及最新檢測(cè)方法、各培養(yǎng)基的選擇和制作該如何進(jìn)行，請(qǐng)大家指教！

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一、培養(yǎng)基配置

我們一般用LB液體培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟：

1．稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加1g瓊脂。

2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂，整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。

3．調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。

4．滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。

5．倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過(guò)程是：①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)放置。

二、滅菌和消毒

1．無(wú)菌技術(shù)：①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

2．消毒方法：①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；②對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；④實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。

3．滅菌方法：①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

三、細(xì)菌的分離

采用劃線分離法，其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。

四、菌落和菌種種類的辨認(rèn)

細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤(rùn)的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長(zhǎng)孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng)；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤(rùn)，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。



共同學(xué)習(xí)

wangqiaomei

樓上朋友謝謝你的回答，有兩個(gè)地方不太明白，
在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基這話啥意思不明白呢？能否說(shuō)清楚點(diǎn)呢？
用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性，偏堿性具體的數(shù)值是多少？

haiwuya

其實(shí)pH值可以不調(diào)的，大腸桿菌對(duì)PH的要求不是特別苛刻。
所謂固體的LB培養(yǎng)基，就是再液體LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%-3%的瓊脂粉，高壓以后，添加了瓊脂粉的培養(yǎng)基在60℃左右倒入平皿中，冷卻后即為固體的平板。在該平板上劃線培養(yǎng)大腸桿菌
順便問(wèn)問(wèn)樓主，你那有普通的光學(xué)顯微鏡嗎？大腸桿菌如果做個(gè)簡(jiǎn)單的革蘭氏染色，在顯微鏡下是很容易分辨的。

haiwuya

其實(shí)pH值可以不調(diào)的，大腸桿菌對(duì)PH的要求不是特別苛刻。
所謂固體的LB培養(yǎng)基，就是再液體LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%-3%的瓊脂粉，高壓以后，添加了瓊脂粉的培養(yǎng)基在60℃左右倒入平皿中，冷卻后即為固體的平板。在該平板上劃線培養(yǎng)大腸桿菌
順便問(wèn)問(wèn)樓主，你那有普通的光學(xué)顯微鏡嗎？大腸桿菌如果做個(gè)簡(jiǎn)單的革蘭氏染色，在顯微鏡下是很容易分辨的。

wangqiaomei

有哈~~~~~