飼料中沙門氏菌的檢測方法

蘇明

求助：飼料中沙門氏菌的檢測方法（最好有WORD電子版），謝謝

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沙門氏菌檢測方法研究進展
　畜禽飼用含有沙門氏菌的飼料，如果菌量達到一定數(shù)目，就可引起疾病或帶菌，因此準確、快速地檢測飼料中的沙門氏菌，對于防止畜禽和人類沙門氏菌污染具有十分重要的意義。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測方法，由于其檢測周期長、漏檢率高、程序復雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的沙門氏菌檢測方法。   
　　1  對傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法的改進   
　　由于檢測沙門氏菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)基選擇性和特異性不能達到今人滿意的效果，沙門氏菌在飼料中的檢出率又較低，而檸檬酸菌屬、變形桿菌等均可能對沙門氏菌的檢測產(chǎn)生干擾，因此傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法需不斷改進，其改進內(nèi)容主要集中在選擇性培養(yǎng)基的選擇上。如由于沙門氏菌具有可特異性地分解丙烯乙二醇產(chǎn)酸，使中性紅指示劑變紅的生化特征，在分離培養(yǎng)基中加入丙烯乙二醇、5一溴一4-氯-3一吲哚一β-D呋喃半乳糖，可實現(xiàn)對沙門氏菌的分離與鑒定工作同步進行，使沙門氏菌檢測所需時間從常規(guī)方法的 4～6 d縮短至2 d；采用Salmosyst培養(yǎng)基進行增菌后，在Rambach培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，可及用對沙門氏菌的快速檢測，大大減少了檢測中所需培養(yǎng)基種類，同時培養(yǎng)過程全部在37℃下進行，操作簡便；采用Salmosyst增菌液，對熱傷害沙門氏菌環(huán)恢復效果，比常規(guī)檢測方法中采用緩沖蛋白胨水和四硫磺酸鹽煌綠增菌液更好，使檢測靈敏度得到較大的提高。   
　　2  快速酶觸反應及代謝產(chǎn)物的檢測   
　　快速酶觸反應是根據(jù)細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將它們配制在相關的培養(yǎng)基中。根據(jù)細菌反應后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助于細菌的快速診斷。這種技術將傳統(tǒng)的細菌分離與生化反應有機的結合起來，并使得檢測結果直觀，成為今后微生物檢測發(fā)展的一個重要發(fā)展方向。據(jù)Manafi等報道，沙門氏菌屬（包括各亞屬）均產(chǎn)生辛酯酶，這一性能是腸桿菌科除沙雷氏菌屬外其它各屬細菌所不具備的，因此可用來鑒別沙門氏菌與腸桿菌科其它屬細菌。近來，Aguirre,Ruiz,Manafi，F(xiàn)reydiere等用意大利Biolife公司的試劑“MUCAP Test”測試腸桿菌科細菌、假單胞菌屬、氣單胞菌屬和類志賀氏鄰單胞菌，證明該法對沙門氏菌有很高的敏感性和特異性，操作也十分簡便、快速。中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準SN 0332－94即為用4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）試劑對沙門氏菌進行檢驗的方法。   
　　3  免疫學方法檢測沙門氏菌抗原或抗體的技術   
　　3．l  抗血清凝集技術   
　　早在1933年，Lancefield就成功地用多價血清對鏈球菌進行了血清分型。隨著抗體制備技術的進一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細菌凝集實驗的特異性，可用于沙門氏菌的分型和鑒定，如以沙門氏菌屬特異單抗HRP標記抗體為核心試劑直接ELISA試驗，為沙門氏菌檢驗和診斷提供了新技術。揚州大學研制兩株針對沙門氏菌屬共同表位的單抗 CBS和 de7它們與 99％的沙門氏菌屬內(nèi)不同血清的沙門氏菌反應，在此基礎上，建立了直接的ELISA方法，并構建了沙門氏菌快速檢測試劑盒。   
　　3．2  乳膠凝集實驗   
　　將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過抗體與相應的細菌抗原結合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應。通常此法需獲得細菌純培育物，再將培養(yǎng)物與致敏乳膠反應。目前FDA認可的產(chǎn)品有Bactigen、Spectate、Microscreen、  Serobact等，見表 l。   
　　3．3  熒光抗體檢測技術   
　　用于快速檢測細菌的熒光抗體技術主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。間接法是在檢樣上滴加已知的細菌特異性抗體，等作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750份食品樣品的檢測，結果表明，與常規(guī)培養(yǎng)法符合率基本一致   
　　3．4  酶聯(lián)免疫測試技術   
　　酶聯(lián)免疫技術應用，大大提高了檢測的敏感性和特異性，現(xiàn)已廣泛地應用在沙門氏菌的檢驗，如Salmonella－TEK、 TECRA、 BacTrce、 Assurance、EQUATE等，見表1。應用酶聯(lián)免疫技術制造的mini-Vidas全自動免疫分析儀，是用熒光分析技術通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標本，其優(yōu)點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48 h的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌。   
　　4  聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術   
　　PCR技術原理為提高DNA探針的敏感性，可先將靶 DNA序列擴增，增加 DNA數(shù)量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動力學為基礎，則能定量分析。1983年 Millus和 Cetus發(fā)明了最基本的擴增 DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法-聚合酶鏈反應即PCR法。PCR法建立在三步重復發(fā)生反應的基礎上。①通過熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成樓板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應。溶液中核苷酸通過酶聚合成相互補對的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA成為下次PCR復制的模板。因此每次循環(huán)特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴增經(jīng)過20～40次循環(huán)能引起100萬倍的擴增。在PCR反應中引人Taq聚合酶使反應得以半自動化和簡便反應程序。用擴增DNA進行的PCR反應具有無與倫比的優(yōu)越性。   
　　 由于沙門氏菌血清型特別繁多（目前世界上已分離出近2 000多個血清型，我國也已發(fā)現(xiàn)了近百個血清型），因此，對沙門氏菌的檢測往往不能準確和靈敏，而 Xiaoming Li（2000），CAROLA  BURTSCHER（1999）， Kapley A．（2000）等利用 PCR技術卻能準確地檢測出微量的沙門氏菌。   
　　5  核酸探針（Nuclear acid Probe）的應用   
　　5．l  核酸探針   
　　 將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認識到特異性核苷酸序列有標記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。   
　　5．2核酸探針的類型   
　　根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據(jù)選用基因的不同分成兩種，一種探針能向微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發(fā)生雜交反應，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測的基因相當保守，包括大部分rRNA，因為它既可能在一種微生物中出現(xiàn)，又可代表一群微生物。   
　　5．3  探針檢測技術中存在的問題   
　　 檢測一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測速度快，但要達到檢測量還要對樣品進行一定時間的培養(yǎng)，任何一種方法不可能有 100％的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽性和假陰性的問題。   
　　沙門氏菌污染量小，常受應激損傷，不易恢復，現(xiàn)用檢測方法得到陰性報告最少需4d陽性報告還要延遲2～3d。研究檢測沙門氏菌的探針難度大，因為它擁有2 000多個血清型， Fillal等人從染色體序列和構建的質(zhì)粒文庫中分離到一個適用于沙門氏菌檢測的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養(yǎng)基發(fā)生非特異性反應。這種用同位素標記的探針，能識別350株不同的沙門氏菌。由于該方法最小檢出量只有 1個細菌／25 g樣品，所以需要增菌培養(yǎng)。   
　　AOAC最近認可了Gene－Trak沙門氏菌比色分析法，見表1。這種探針標記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過氧化酶標記抗FITC的抗體結合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對239株沙門氏菌的特異性檢出率為 100％，假陽性率為 0．8％。   
表1  美國FDA認可使用的沙門氏菌檢測系統(tǒng)和試劑盒   
類別              商品名稱          分析手段   
沙門氏菌     Automicrobic,GNI       生化試驗   
               
自動檢測系統(tǒng)            
核酸雜交分析     GENE-TRAK           同位素   
                GENE-TRAK           比色法   
   
免疫分析         Bactigen             LA   
                Spectate             LA   
              Microscreen            LA   
                Wellcolex            LA   
                Serobact             LA   
                                     LA   
                1-2 Test       Immuno-Diffusion   
                PATH-STIK        Dipstick-EIA   
             Salmonella-TEK          EIA   
                  TECRA              EIA   
                  Unique         Dipstick-EIA   
             Salmonella-TEK          EIA   
                  TECRA              EIA   
                  Unique         Dipstick-EIA   
                 EQUATE              EIA   
                BacTrace             EIA   
               Assurance             EIA   
                Isogrid              HGMF   
其它商品化        OSRT           Medium/motility   
快速檢測方法    Rambach              Medium   
和培養(yǎng)基         MUCAP            C8,Esterase   
                XLT-4               Medium   

　　注：EIA，酶免疫分析；LA，乳膠凝集；HGMF疏水格柵濾膜；MUCAP，4-甲基傘形酮酮辛酯（4-Methylumbelifefylcaprylate）。   
　　6  沙門氏菌檢測儀器及自動化系統(tǒng)   
　　近年來，隨著計算機技術的不斷發(fā)展，對病原微生物的鑒定技術朝著微量化、系列化、自動化的方向發(fā)展，從而開辟了微生物檢測與鑒定的新領域。最有代表性的是AMS微生物自動分析系統(tǒng)，見表1。   
　　AMS為美國VITEK廠產(chǎn)品，屬于自動化程度高的儀器，由7個部件組成應用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。   
　　操作時，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結果。   
　　該套系統(tǒng)檢測卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應指標，基本同常規(guī)檢測鑒定，檢測所需時間最長不超過 20 h。   
　　7  其它沙門氏菌檢測方法   
　　ISO－GRID檢測系統(tǒng)（表1）是一種基于疏水性網(wǎng)膜（HGMF）的過濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過使用這種含有1600個小方格的濾膜，來對微生物進行檢測或計數(shù)。   
　　首先，稀釋的樣品通過5 um的不銹鋼預過濾器過濾，過濾掉可能引起微生物分析誤差的樣品殘渣顆粒。   
　　然后，樣品通過流水的濾膜過濾。再將濾膜放在特異性的瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)，以檢測目標微生物。培養(yǎng)完成后，在膜上檢測目標微生物，并記錄陽性區(qū)域的數(shù)量。   
　　濾膜不會染上瓊脂培養(yǎng)基的顏色，從而很容易地區(qū)別微生物，并進行鑒別和記數(shù)。此方法快速簡便，重復性好，而且，除沙門氏菌外，還適用于大腸桿菌O157﹕H7、酵母、霉菌、大腸菌群及大腸桿菌的檢測和計數(shù)。