纖維素酶在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用

春節(jié)

　　自從1906年Seiiliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)能夠分解天然纖維素的纖維素酶以來，纖維素酶的研究受到動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)界的普遍關(guān)注，尤其是近年來隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶生產(chǎn)和應(yīng)用的研究取得了一定成果。

　　纖維素酶的種類

　　纖維素酶按其來源可分為真菌源性纖維素酶和細(xì)菌源性纖維素酶兩種。細(xì)菌源性地纖維素酶來源于分解纖維素的細(xì)菌，如瘤胃細(xì)菌（黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等）和熱纖梭菌等，產(chǎn)量和活性較低。真菌源性纖維素酶來源非常廣泛，所有能分解晶體纖維素的真菌，均能或多或少地分泌纖維素酶。目前，國(guó)內(nèi)外工廠化生產(chǎn)采用的菌種大多數(shù)是木霉、曲霉和青霉等。生產(chǎn)高質(zhì)量纖維素酶的關(guān)鍵是高產(chǎn)菌株的選育，我國(guó)自20世紀(jì)70年代就開始了這方面研究，目前已利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)進(jìn)行誘變培養(yǎng)，選育出了康代木霉NT15－H、NT15—HI、黑曲霉XT15—H、XT15—HI、綠色木霉等高產(chǎn)菌株，并投入工廠化生產(chǎn)。

　　纖維素酶的組成

　　纖維素酶是一種多組分的酶系，采用各種層析、電泳等技術(shù)可將纖維素酶分成不同的組分。就目前研究結(jié)果看，至少包括三類性質(zhì)不同的酶。

　　內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶來自真菌簡(jiǎn)稱EG，來自細(xì)菌簡(jiǎn)稱Len。這類酶一般作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖音鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素如纖維糊精、纖維二糖、纖維三糖等。

　　外切β-1，4—葡聚糖酶來自真菌簡(jiǎn)稱CBH，來自細(xì)菌簡(jiǎn)稱Cex。此類酶可從纖維素酶的非還原末端一個(gè)一個(gè)地依次切下葡萄糖單位，產(chǎn)物為α一葡萄糖。該酶對(duì)纖維寡糖的親和力強(qiáng)，能迅速水解內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的纖維寡糖，其專一性較強(qiáng)。

　　β-葡萄糖著酶簡(jiǎn)稱BG。該酶可水解纖維二糖和短鏈纖維寡糖生成葡萄糖。對(duì)纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。該酶的專一性差，實(shí)際上可作用于所有的葡萄糖β-二聚物。

　　三類酶的協(xié)同降解機(jī)制。上述三類纖維素酶在分解纖維素時(shí)，任何單獨(dú)一種都不能裂解晶體纖維素，只有三種酶共同存在并協(xié)同作用時(shí)才能完成水解過程。一般來說，外切酶作用于不溶性纖維素的表面，使形成晶體結(jié)構(gòu)的纖維素分子鏈裂開，長(zhǎng)鏈分子末端部分發(fā)生游離，從而使纖維素易于水化；內(nèi)切酶則作用于經(jīng)外切酶活化的纖維素，分解其β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖；β-葡聚糖苷酶再將纖維二糖、纖維三糖等分解為葡萄糖。應(yīng)當(dāng)指出，該協(xié)同降解作用的順序不是絕對(duì)的，而且各酶的功能也不是這樣簡(jiǎn)單固定的。

　　纖維素酶的理化性質(zhì)

　　不同來源的纖維素酶理化性質(zhì)不盡相同。同一菌株產(chǎn)生的同一酶在不同報(bào)道中也存在一定的差異。如報(bào)道的來源于擬氏木霉的β-葡萄糖苷酶的最適pH值為6.5，在40℃下最穩(wěn)定，以纖維H糖為底物的Km為33nunol／l，分子量為98KD，據(jù)研究者描述的擬氏木霉來源的β-葡萄糖甘醇的分子量為47KD，等電點(diǎn)（PI）為5．47。

　　多數(shù)真菌和少數(shù)細(xì)菌的纖維素酶都可糖基化。糖基與蛋白質(zhì)間以共價(jià)鍵結(jié)合，或呈可解離的絡(luò)會(huì)狀態(tài)。糖基化作用在一定程度上可保護(hù)纖維素酶免受蛋白酶的水解，同時(shí)，纖維素酶由于糖基化使其所含碳水化合物比例在不同酶之間發(fā)生差異，導(dǎo)致酶的多形式和分子量的差異。真菌的EG包括兩種異構(gòu)酶EGI和EGlll。EGI的等電點(diǎn)為4．2，分子量為54KD，由437個(gè)氨基酸組成。EGHl的等電點(diǎn)為4．8～5．6，分子量為49．SKD，由397個(gè)氨基酸組成。木霉的CBH的異構(gòu)酶為CBHI和CBHI。其中CBHI的等電點(diǎn)為4．2，分子量為66KD，由496個(gè)氨基酸組成。CBHI的等電點(diǎn)為59，分子量為53KD，由447個(gè)氨基酸組成。BG的等電點(diǎn)為7．5～8．5，分子量為70KD～80KD，由714個(gè)氨基酸組成。

　　纖維素酶的基因克隆和高效表達(dá)

　　迄今為止，人們已經(jīng)從40多種細(xì)菌和數(shù)種真菌中克隆到了纖維素酶的基因，其中大多數(shù)的核苷酸序列已被測(cè)定。

　　大多數(shù)克隆的纖維素酶基因能夠在E．coli中表達(dá)出可檢測(cè)的EG和CBH活力。利用重組大腸桿菌高效表達(dá)了來源于菊歐文氏菌的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因celZ。但在大腸桿菌中表達(dá)纖維素酶基因存在兩個(gè)問題，一是不易提取，二是表達(dá)水平低。為此，人們將目光轉(zhuǎn)向了真核表達(dá)系統(tǒng)。目前，應(yīng)用較多的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母作為一般傳統(tǒng)的工業(yè)微生物不產(chǎn)生毒素，用其表達(dá)纖維素酶基因，其產(chǎn)物高度糖基化，經(jīng)正確加工修飾可直接分泌到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平高。如酵母表達(dá)的李氏木霉CBHll、EGI的產(chǎn)量可達(dá)100mgh以上，并具有正常的生物學(xué)活性。

　　纖維素酶的作用機(jī)理

　　補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，刺激內(nèi)源酶分泌

　　不同動(dòng)物消化道的酶系組成不同。牛羊等反芻動(dòng)物消化道中雖有一定量的微生物存在，但產(chǎn)生的纖維素酶數(shù)量有限，使纖維素的消化吸收受到一定限制。而雞豬等單胃動(dòng)物由于體內(nèi)缺乏內(nèi)源性纖維素酶不能消化纖維素，導(dǎo)致日糧中占相當(dāng)比例的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨纖維素作為糞便排出。添加纖維素酶可補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，提高動(dòng)物對(duì)粗纖維的利用率。同時(shí)，還可改善消化道酶系的組成、酶量及活性。

　　破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收

　　植物的細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等組成。它們?cè)诩?xì)胞外形成一層穩(wěn)定而堅(jiān)固的外殼，阻止了畜禽對(duì)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。纖維素酶可在半纖維素酶、果膠酶等的協(xié)同作用下，破壞植物的細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物裸露出來，被淀粉酶和蛋白酶進(jìn)一步降解，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率。

　　消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值

　　植物性飼料進(jìn)入畜禽消化道后，其中的纖維素、半纖維素、果膠等大分子物質(zhì)可部分溶解產(chǎn)生黏性溶液，使消化道內(nèi)容物的新度增加，對(duì)內(nèi)源酶形成了一個(gè)物理屏障，從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。日糧中添加纖維素酶以后，在半纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶等的共同作用下，可將纖維素、半纖維素、果膠、戊糖等大分子物質(zhì)降解為單糖和寡糖，使消化道內(nèi)容物的濃度降低，增加內(nèi)源酶的擴(kuò)散，增大酶與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。

　　纖維素酶的應(yīng)用現(xiàn)狀

　　應(yīng)用方法

　　在實(shí)際生產(chǎn)中，通常將纖維素酶與半纖維素酶、果膠酶、β－葡聚糖酶等組成復(fù)合酶添加到飼料中。目前，國(guó)內(nèi)外利用纖維素酶的方法有體外酶解法和體內(nèi)酵解法兩種。前者是把纖維素酶和秸稈飼料拌勻，在一定溫度、濕度和pH值下堆積或密封發(fā)酵一定時(shí)間，晾干后直接飼喂動(dòng)物。該法效果好，但費(fèi)工費(fèi)時(shí)，成本高。后者是把纖維素酶以添加劑的形式加到精料內(nèi)，拌勻后飼喂動(dòng)物，借助于動(dòng)物消化道的內(nèi)環(huán)境發(fā)揮作用。該法簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣泛。

　　飼喂效果

　　在綿羊日糧中每只每日添加纖維素酶309，使處于牧草期的綿羊日增重提高了5．41％，使處于枯草期的綿羊日增重提高了4．91％，同時(shí)使羊毛的產(chǎn)量提高了5．04％。用閹牛試驗(yàn)，在日糧中按每頭每日添加纖維素酶409，飼喂60天。結(jié)果表明，對(duì)照組日增重為764．8g，差異極顯著（P<0.01）。

　　在豬基礎(chǔ)日糧中添加0．6％和1．2％的纖維素復(fù)合酶，結(jié)果生長(zhǎng)育肥豬增重比對(duì)照組分別提高了16.84％和21.86％。添加纖維素酶后，使中性洗滌纖維的消化率由30．3％提高到34.1％，酸性洗滌纖維從68．8％提高到73．9％。在以玉米—豆粕為基礎(chǔ)的日糧中添加纖維素酶對(duì)生長(zhǎng)豬的生產(chǎn)性能無作用。添加纖維素酶制劑，除能提高大麥—豆粕型日糧中蛋白和能量的消化利用率外，其他日糧如典型的玉米—豆粕日糧，對(duì)豬的生長(zhǎng)性能無影響。

　　存在問題

　　纖維素酶的應(yīng)用雖取得了一定的成果，但存在諸如菌種產(chǎn)酶量低、活力低、最佳添加量和添加方式不明確、成本高及儲(chǔ)存加工影響酶穩(wěn)定性等問題。今后研究的重點(diǎn)主要放在提高酶產(chǎn)量、活力和穩(wěn)定性上。此外，可采用生物工程技術(shù)（基因克隆、基因表達(dá)、纖維素酶蛋白分子的改造和設(shè)計(jì)）來獲取高產(chǎn)纖維素酶。

　　綜上所述，纖維素酶可提高飼料利用率，改善粗飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降低飼料成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。今后應(yīng)對(duì)纖維素酶的檢測(cè)方法、作用機(jī)制，酶系組成、耐熱性、作用溫度、pH值和抗蛋白酶水解能力等方面進(jìn)行深入研究。

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