抗菌肽知識(shí)系列大講堂（十）

輕松由我 · 發(fā)表于 2010-5-4 15:58:23

抗菌肽的基因工程表達(dá)（二）

酵母表達(dá)系統(tǒng)：

1. 酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)
雖然大腸桿菌是目前最為成熟的基因表達(dá)系統(tǒng)，但作為原核生物，它不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，也不具有對(duì)外源蛋白的加工修飾能力。近年來(lái)，人們已經(jīng)將注意力轉(zhuǎn)移至跟大腸桿菌同樣具有繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單、可工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)的酵母表達(dá)系統(tǒng)，并且除了上述優(yōu)點(diǎn)以外還具有使蛋白折疊、磷酸化、糖基化、酰胺化等修飾能力，避免了蛋白以包涵體形式表達(dá)、活性降低等問(wèn)題。

酵母表達(dá)系統(tǒng)中最早使用的是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曾經(jīng)用其成功表達(dá)過(guò)干擾素、胰島素等外源基因，但在工業(yè)應(yīng)用時(shí)其缺點(diǎn)也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，如培養(yǎng)基成本高、容易發(fā)生過(guò)度糖基化、質(zhì)粒丟失、拷貝數(shù)下降等。為了克服釀酒酵母的局限，美國(guó)Daly等最先發(fā)展了以甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母(Methylotrophic yeast)為代表的第2代酵母表達(dá)系統(tǒng)。其中巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是發(fā)展最為迅速的，最初這種酵母菌是用于生產(chǎn)家畜飼料單細(xì)胞蛋白，它可以在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其細(xì)胞中含有醇氧化酶(Alcoholoxydase，AOX)、二羥丙酮合成酶、過(guò)氧化氫酶等甲醇代謝途徑必須的酶。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有多種有利于外源基因表達(dá)的優(yōu)勢(shì)，與其他系統(tǒng)相比，更加便捷、高效，近幾年每年報(bào)道的在畢赤酵母中表達(dá)的外源基因就有幾十種。美國(guó)FDA評(píng)價(jià)該系統(tǒng)是安全的，并且已有來(lái)自于該表達(dá)系統(tǒng)的蛋白類(lèi)制劑獲得批準(zhǔn)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有以下特點(diǎn)：

(1)巴斯德酵母具有很強(qiáng)的醇氧化酶基因(AOX)啟動(dòng)子，可以嚴(yán)格調(diào)控異源蛋白的表達(dá)。

(2)巴斯德畢赤酵母有完備的發(fā)酵方法，可高密度連續(xù)培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重可達(dá)100g/l以上，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

(3)巴斯德畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)量較高，并且既可以在胞內(nèi)積聚又可以分泌到細(xì)胞外，而其自身的分泌蛋白非常少，有利于純化。

(4)異源蛋白借助質(zhì)粒以單拷貝或多拷貝的形式整合到巴斯德畢赤酵母基因組中，有助于穩(wěn)定遺傳。

(5)巴斯德畢赤酵母翻譯后加工過(guò)程中的糖基化程度更合理。

當(dāng)然除了上述優(yōu)點(diǎn)，目前甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)也還存在著一些問(wèn)題，如某些蛋白的表達(dá)量相對(duì)較低甚至不能表達(dá)；分泌表達(dá)產(chǎn)物不均一，存在聚合體、信號(hào)肽加工不完全、表達(dá)產(chǎn)物降解等。所以在實(shí)驗(yàn)中還需不斷地摸索。

2. 基因的構(gòu)建及表達(dá)
目的基因的獲得可以從動(dòng)物體中提取RNA，將其反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后得到cDNA，利用此方法已經(jīng)得到豬抗菌肽PR-39基因；或根據(jù)抗菌肽氨基酸殘基種類(lèi)和其殺菌活性的相關(guān)性，替換某幾個(gè)氨基酸或?qū)?/font>2種抗菌肽基因結(jié)合構(gòu)造雜合肽。如將cecropin Bl5和17等位點(diǎn)的氨基酸替換后，其抗菌活性明顯提高；cecropin A N端1～7位和Milittin N端5～12位氨基酸雜合后，其產(chǎn)物具有熱穩(wěn)定性和高抑菌活性。目前在巴斯德畢赤酵母已表達(dá)的抗菌肽包括：人源抗菌肽LL-37，通過(guò)克隆cDNA，得到111 bp的重組基因，已在X一33中表達(dá)，所用質(zhì)粒為pGAPZB；來(lái)源于中國(guó)家蠶的ABP—CM4，在GSll5中以pPICZaA為載體，得到了3．8 ku的表達(dá)產(chǎn)物；Jin等同樣以pPICZaA為載體，在SMDll68中表達(dá)了cecropinA和magain-in2的雜合肽。