飼料原料、飼料中霉菌毒素快速檢測新技術(shù)研究與應(yīng)用

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摘要：本文通過對(duì)當(dāng)前霉菌毒素污染現(xiàn)狀的展現(xiàn)以及對(duì)傳統(tǒng)霉菌毒素檢測技術(shù)的對(duì)比分析，著重提出了霉菌毒素檢測技術(shù)的重要性和實(shí)際應(yīng)用存在的問題，也直接指出了生產(chǎn)一線對(duì)于霉菌毒素檢測技術(shù)的迫切需求，通過對(duì)傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的免疫方法的分析和論證，在充分結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際以及對(duì)于霉菌毒素問題解決要求的基礎(chǔ)上，充分吸收了現(xiàn)有檢測技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)了新型金標(biāo)抗體快速檢測試紙條，徹底解決生產(chǎn)單位對(duì)于各種原材料霉菌污染情況滯后控制的被動(dòng)局面的實(shí)際問題，對(duì)整個(gè)飼料養(yǎng)殖行業(yè)乃至食品行業(yè)的產(chǎn)品安全保障起到了強(qiáng)化作用，對(duì)進(jìn)一步提高飼料轉(zhuǎn)化率和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重大促進(jìn)作用。于此同時(shí)，就當(dāng)前在飼料養(yǎng)殖領(lǐng)域普遍推廣的霉菌毒素吸附劑使用技術(shù)也進(jìn)行了科學(xué)的分析，為這些成品的應(yīng)用提供了可靠性依據(jù)。文章同時(shí)還為其他快速檢測技術(shù)的研發(fā)提供了參考思路。
關(guān)鍵詞：飼料原料  霉菌毒素  危害  快速檢測  金標(biāo)抗體  試紙  現(xiàn)場
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趙曉慶

飼料原料、飼料中霉菌毒素快速檢測新技術(shù)研究與應(yīng)用
徐   超
上海澳靈生物科技有限公司
摘要：本文通過對(duì)當(dāng)前霉菌毒素污染現(xiàn)狀的展現(xiàn)以及對(duì)傳統(tǒng)霉菌毒素檢測技術(shù)的對(duì)比分析，著重提出了霉菌毒素檢測技術(shù)的重要性和實(shí)際應(yīng)用存在的問題，也直接指出了生產(chǎn)一線對(duì)于霉菌毒素檢測技術(shù)的迫切需求，通過對(duì)傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的免疫方法的分析和論證，在充分結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際以及對(duì)于霉菌毒素問題解決要求的基礎(chǔ)上，充分吸收了現(xiàn)有檢測技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)了新型金標(biāo)抗體快速檢測試紙條，徹底解決生產(chǎn)單位對(duì)于各種原材料霉菌污染情況滯后控制的被動(dòng)局面的實(shí)際問題，對(duì)整個(gè)飼料養(yǎng)殖行業(yè)乃至食品行業(yè)的產(chǎn)品安全保障起到了強(qiáng)化作用，對(duì)進(jìn)一步提高飼料轉(zhuǎn)化率和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重大促進(jìn)作用。于此同時(shí)，就當(dāng)前在飼料養(yǎng)殖領(lǐng)域普遍推廣的霉菌毒素吸附劑使用技術(shù)也進(jìn)行了科學(xué)的分析，為這些成品的應(yīng)用提供了可靠性依據(jù)。文章同時(shí)還為其他快速檢測技術(shù)的研發(fā)提供了參考思路。
關(guān)鍵詞：飼料原料  霉菌毒素  危害  快速檢測  金標(biāo)抗體  試紙  現(xiàn)場
眾所周知，在各種農(nóng)產(chǎn)品上生長著各種各樣的霉菌，這些霉菌在一定的環(huán)境條件刺激下，都能產(chǎn)生霉菌毒素，霉菌毒素是一類有毒的化合物，有些甚至是致癌的（如黃曲霉毒素）。霉菌毒素有很多種（CAST,2003），包括黃曲霉毒素，主要是黃曲霉毒素B1和M1（Aflatoxins，F(xiàn)B1、FM1）；赭（棕）曲霉毒素A（OchratoxinA，OA）；雜色（柄）曲霉毒素（Terigmatocystin）；展青霉素（Patulin,PTL）；玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN(F－2)）;串珠鐮刀菌素（Moniliformin,MF），三硝基丙酸以及屬于單端孢霉烯族化合物（Trichothecenes）的T－2毒素（T－2toxin,T－2）；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）（Deoxynivalenol,DON）；二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（Diacetoxyscirpenol，DAS）等。
聯(lián)合國糧農(nóng)組織也在近期的報(bào)道中指出，為了保障人類的健康，全世界至少99個(gè)國家，占世界人口的87％，針對(duì)糧食和飼料的霉菌毒素污染問題都有相關(guān)的規(guī)定，有些規(guī)定限量還非?？量?。在未來的幾年里，不斷變化的全球氣候突發(fā)事件的增多將進(jìn)一步向我們提出挑戰(zhàn)。霉菌毒素污染給糧食生產(chǎn)者、 家禽生產(chǎn)者以及食品和飼料的加工企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中國的霉菌毒素污染問題也不例外，根據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)計(jì)成教授等多年來的的調(diào)查結(jié)果顯示，中國境內(nèi)的霉菌毒素污染問題相當(dāng)嚴(yán)重，根據(jù)污染程度的輕重，將中國劃分為四個(gè)區(qū)域（見下圖1）。
圖1  中國區(qū)域內(nèi)霉菌毒素污染現(xiàn)狀分布圖
備注：B1區(qū)域?yàn)檩p污染區(qū)；B2為一般污染區(qū)；B3是中度污染區(qū)；B4是超重度污染區(qū)。
從上圖分布情況可以看出，一向認(rèn)為是沒有霉菌毒素污染地區(qū)的北方大部分地區(qū)，同樣被霉菌污染所包圍，因此，霉菌毒素的廣泛存在以及霉菌毒素對(duì)我們身體健康的影響已經(jīng)引起了各級(jí)政府的高度關(guān)注，隨之一系列有關(guān)食品安全、飼料安全的法規(guī)和制度也先后出臺(tái)了，而且大多數(shù)為強(qiáng)制性執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)也因?yàn)樵絹碓蕉嗟酿B(yǎng)殖企業(yè)開始大量使用霉菌毒素吸附劑，飼料企業(yè)也開始密切關(guān)注霉菌毒素吸附劑的使用情況，但是在使用的過程中，一直存在著一些疑問：是不是每批原料都需要使用脫毒技術(shù)？是不是每批原料的毒素吸附劑使用劑量都相等？諸如此類疑惑藏在從業(yè)人員心間，于是有些客戶就不斷尋找一種可以在使用吸附劑前快速檢測原料中霉菌毒素污染程度的技術(shù)，只有這樣才可以為飼料中添加霉菌毒素吸附劑提供現(xiàn)場的直接的原始依據(jù)。所以研究并開發(fā)飼料原料以及飼料中霉菌毒素污染程度的快速檢測技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)市場的迫切需求了。
一、飼料霉變對(duì)畜牧業(yè)的危害
霉菌毒素污染的飼料對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能帶來的負(fù)面影響有些是察覺不到的， 有些卻是破壞性的。世界范圍內(nèi)，養(yǎng)殖業(yè)每年因霉菌毒素對(duì)飼料的污染造成的經(jīng)濟(jì)損失就有幾百億美元。如黃曲霉毒素污染造成經(jīng)濟(jì)損失包括它能使動(dòng)物生長受阻、 飼料適口性降低、食欲減退、飼料轉(zhuǎn)化效率下降、死亡率增加、降低繁殖性能、蛋雞產(chǎn)蛋量減少、 肉雞腿病和胴體污染、內(nèi)臟出血、肝臟受損、胚胎中毒和對(duì)環(huán)境應(yīng)激和病原微生物的抵抗力下降等等。肉雞黃曲霉毒素中毒后，血液中總蛋白、 膽固醇和血液尿素氮的含量減少。還發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素影響維生素D的代謝，造成骨骼強(qiáng)度下降，腿軟弱無力。另外黃曲霉毒素還影響幾種礦物元素的代謝，如鐵（引起溶血性貧血）、 磷（引起腿軟弱無力）。
霉菌毒素主要通過影響細(xì)胞和體液免疫功能來降低動(dòng)物機(jī)體的抵抗力。大量研究表明，黃曲霉毒素引起肉雞的免疫功能抑制進(jìn)而增加對(duì)疾病的易感性，飼以蛋雞50～200μg/kg黃曲霉毒素的日糧，其產(chǎn)蛋率和孵化率顯著降低；對(duì)肉雞的研究表明，日糧中100～200μg/kg的黃曲霉毒素可顯著降低嗉囊重量，對(duì)肉雞免疫功能產(chǎn)生不良影響。當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸單端孢霉毒素后，會(huì)導(dǎo)致其對(duì)傳染病的易感性。黃曲霉毒素對(duì)免疫系統(tǒng)的影響有如下幾方面：法氏囊和胸腺的體積變小；Ｔ淋巴細(xì)胞、Ｂ淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量減少；血清總蛋白和免疫球蛋白水平降低；抗體滴度下降；血清中抗生素濃度下降等。單端孢霉毒素也可影響抗體的產(chǎn)生，這使得機(jī)體反應(yīng)在免疫程序中減弱。同樣赭曲霉毒素A對(duì)免疫功能有抑制作用，這和赭曲霉毒素的致癌作用有直接的聯(lián)系。
霉菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物（主要是霉菌毒素）在動(dòng)物性食品中殘留可通過食物鏈而對(duì)人類健康構(gòu)成潛在危害。例如黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素B1在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。存在于動(dòng)物的乳汁、肝、蛋類等可食部分，常見于乳汁中，它有很強(qiáng)的毒性和致癌性。由于乳及乳制品是嬰幼兒的主食，而嬰幼兒的解毒功能器官發(fā)育不完善，因此黃曲霉毒素M1對(duì)嬰幼兒健康有直接的威脅，在實(shí)際生產(chǎn)中，嚴(yán)格控制奶牛飼料中黃曲霉毒素B1的含量對(duì)保障奶及奶制品安全具有直接的現(xiàn)實(shí)意義。同樣赭曲霉毒素A在動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留問題也應(yīng)引起高度重視，Krogh等證實(shí)該毒素可在腎、肝和肌肉中殘留（見下表1、表2）。
從表1可以看出，我們?nèi)祟惖脑S多重癥和不治之癥都和霉菌毒素的污染密切相關(guān)，要攻克疾病治愈難題，首先要攻克霉菌毒素污染的治理難關(guān)。
從表2可以看出，盡管霉菌毒素污染很嚴(yán)重，其對(duì)于動(dòng)物的健康危害非?？膳拢菍?duì)于不同的動(dòng)物來說，不同的霉菌毒素對(duì)其的影響是有差異的。而事實(shí)上同一種霉菌毒素對(duì)于動(dòng)物的不同生長階段，其影響也是不同的，一般而言幼小動(dòng)物對(duì)于霉菌毒素的敏感度要高于成年動(dòng)物。
另外，由于絕大多數(shù)霉菌毒素中毒的動(dòng)物表現(xiàn)癥狀都不是急性發(fā)作的，而是逐漸積累到一定程度突破動(dòng)物自身的耐受限度后才表現(xiàn)出來，因此霉菌毒素的危害有很強(qiáng)的隱蔽性，加上各種霉菌毒素之間存在著協(xié)同疊加效應(yīng)（如表3列舉），因此，當(dāng)飼料中存在多種霉菌毒素時(shí)，其毒害效應(yīng)往往比單一毒素的危害要增強(qiáng)數(shù)倍乃至數(shù)十倍。
表1 已經(jīng)被確認(rèn)的疾病的元兇

表2  霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的危害

表3  霉菌毒素之間的協(xié)同效應(yīng)

綜上所述，生產(chǎn)單位技術(shù)人員只有掌握了飼料中的主要霉菌毒素污染程度（根據(jù)不同動(dòng)物敏感度確定主要毒素種類），才能夠科學(xué)的制定解決方案，合理的把霉菌毒素危害降到最低。所以對(duì)飼料原料和飼料本身開展毒素檢測至關(guān)重要。
二、飼料中霉菌毒素的定性與定量檢測技術(shù)
目前已經(jīng)被大家所熟悉并接納的檢測技術(shù)主要有以下幾種：
一類是生物學(xué)檢測法, 包括種子發(fā)芽試驗(yàn)、嘔吐試驗(yàn)等，但是檢測結(jié)果的時(shí)效性很差，在實(shí)際生產(chǎn)中已很少采用；另一類是理化檢測法, 薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC雖然簡便，但靈敏度差； HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操作復(fù)雜，儀器昂貴，標(biāo)準(zhǔn)品耗用大。還有一類是利用免疫化學(xué)原理開展的實(shí)驗(yàn)室快速檢測法，如ELISA方法---即酶聯(lián)免疫法。
2.1目測法
當(dāng)出現(xiàn)畜禽拒食，飼料和谷物發(fā)熱，有輕度異，色澤變暗，飼料結(jié)塊等跡象時(shí)應(yīng)考慮飼料可能霉變。因霉菌都是從霉菌孢子或是菌絲體碎片開始生長的，霉菌生長時(shí)消耗了養(yǎng)分，代謝中有能量釋放，故而使飼料變色、變味、發(fā)熱。
菌絲體可與飼料縱橫交織，形成菌絲蛛網(wǎng)狀物，這些結(jié)構(gòu)使得飼料結(jié)塊。在我們?nèi)庋鬯軌蛴^察到這些菌絲網(wǎng)狀物以前，菌絲體已經(jīng)在大范圍內(nèi)生長繁殖。因此，飼料結(jié)塊是診斷飼料霉變的最簡易實(shí)用的方法之一。
不同的霉菌菌落各有其特征，通過顯微鏡觀察可進(jìn)一步檢測確認(rèn)。
另外飼料養(yǎng)殖企業(yè)經(jīng)常采用的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)方法也屬于此類（在1000粒玉米顆粒中檢出多少粒發(fā)霉的顆粒，控制標(biāo)準(zhǔn)為低于2%），但是這種方法一般只是直觀檢測有霉菌的情況，并不能對(duì)于隱含其內(nèi)部肉眼看不見的霉菌毒素給出精確判定，實(shí)際上并不可靠，因?yàn)槊咕兔咕舅厥莾蓚€(gè)不同的概念。
2.1.1　曲霉屬　
本屬菌的菌落顏色多樣，而且比較穩(wěn)定，是分類的主要特征之一。曲霉菌落表面一般呈絨毛狀，起初為白色或灰白色，長出孢子后則顯現(xiàn)出不同的顏色，隨菌種而異。如黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株長出黃綠色分生孢子，此時(shí)將培養(yǎng)皿置于365 nm紫外燈下，菌絲體出現(xiàn)亮紫色熒光。寄生曲霉由致密的基層菌絲組成，具有較寬、白色、幾乎不形成孢子的邊緣，前期呈明顯的淡黃色，以后呈草綠色，最后呈暗濁黃綠色,其小梗是純單層。雜色曲霉小梗嚴(yán)格雙層,分生孢子頭呈典型的放射狀，明顯的綠色，分生孢子梗無色或淺褐色。
2.1.2　青霉屬　
青霉的菌落大多呈灰綠色。菌落有絨狀、絮狀、繩狀和束狀4種類型。有的青霉菌菌落具有放射性皺褶，有的形成同心輪紋，有的在基質(zhì)表面有滲出液。顯微鏡下觀察時(shí)可見到獨(dú)特的帚狀體結(jié)構(gòu)。
2.1.3　鐮刀菌屬　
鐮刀菌菌落一般呈白色絨毛狀，常產(chǎn)生可溶性色素。分生孢子有大小2種類型，顯微鏡下大型分生孢子大多呈鐮刀形，多隔；小型分生孢子有卵形、梨形、圓形和柱形等。
2.2薄層層析法(TLC)
TLC法是我國測定食品及飼料中霉菌毒素的國家標(biāo)準(zhǔn)方法之一，其原理是針對(duì)不同的樣品，用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來，經(jīng)柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，利用霉菌毒素的熒光性，根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較測定其最低含量。TLC法由于設(shè)備簡單，易于普及，所以國內(nèi)外仍在使用，但該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質(zhì)較多，在展開時(shí)影響斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，而雙向展開雖避免了雜質(zhì)干擾，但增加了操作步驟和時(shí)間(葉雪珠,2003)。此類方法和前面的目測法仍然偏重于定性檢測。
2.3色譜法(HPLC)
色譜法，包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜等，一直是最重要的真菌毒素的化學(xué)分析方法。薄層色譜由于方法靈敏度和分離效率等問題，1985年以后便很少用了，然而，在發(fā)現(xiàn)確證新毒素、快速監(jiān)測方法建立、毒素分析方法研究等方面，尤其是當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件有限時(shí)，薄層色譜依然有其優(yōu)越性；氣相色譜，包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，更多的是用在單端孢霉烯族毒素的分析上；現(xiàn)在比較普遍的真菌毒素的分析方法還是液相色譜法，包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在方法適用性、分離效率和靈敏度方面，液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)都是其他方法所無法替代的。近年來，毛細(xì)管電泳及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其高分離效率也開始應(yīng)用在真菌毒素分析領(lǐng)域并引起了廣泛關(guān)注。
總之，HPLC法是近幾年發(fā)展起來的檢測霉菌毒素方法，主要是用熒光檢測器檢測，在適宜的流動(dòng)相條件下，采用反相C18柱，使霉菌毒素同時(shí)分離。該法快速而準(zhǔn)確，純化效果好，最低檢出量0.08ng，回收率為92.87%，但需要昂貴的儀器設(shè)備，一般僅限于專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)獲得科研和調(diào)查分析、監(jiān)測使用，未能在企業(yè)廣泛推廣使用，而且其結(jié)果的滯后效應(yīng)大大降低了對(duì)生產(chǎn)實(shí)際的指導(dǎo)效果。
2.4免疫化學(xué)檢測法
免疫學(xué)檢測方法是基于抗體與抗原或半抗原之間的選擇性反應(yīng)而建立起來的一種生物化學(xué)分析法，該方法橫跨細(xì)胞免疫學(xué)學(xué)科、分子免疫學(xué)學(xué)科、生理生化學(xué)科等諸多學(xué)科領(lǐng)域，是一種多學(xué)科交叉后產(chǎn)生的新技術(shù)。由于免疫反應(yīng)的特異性特點(diǎn)，此種方法具有較高的選擇性和很低的檢出限，廣泛用于各種抗原、半抗或抗體的測定，一般可分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、免疫法及電化學(xué)免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在飼料霉菌毒素檢測中應(yīng)用較廣的主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），也可以稱作是實(shí)驗(yàn)室快速檢測法，1977年美國Lawell 等首先建立了ELISA競爭法檢測AFB1 。隨后美國學(xué)者朱繁生教授、英國學(xué)者M(jìn)organ 教授分別改進(jìn)了該法。我國李秀芳和俞順章教授分別于1987年與90 年代建立了ELISA 法檢測AFB1 ，成恒嵩教授等起草了飼料中AFB1 的ELISA檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)，并于1998 年由國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局正式批準(zhǔn)頒布實(shí)施。
ELISA 法特別適宜大批樣品的集中檢測，相對(duì)于單個(gè)飼料企業(yè)來說，本方法在實(shí)際應(yīng)用上存在著明顯的缺陷。目前有較多的集團(tuán)性農(nóng)牧企業(yè)在集團(tuán)總部檢測中心建立了ELISA檢測實(shí)驗(yàn)室，也有個(gè)別飼料企業(yè)購置了酶標(biāo)儀開展檢測，但是無論是集團(tuán)性檢測還是單個(gè)飼料企業(yè)開展檢測，都由于收到檢測樣品數(shù)量的限制以及送檢集團(tuán)總部的時(shí)間限制性和檢測成本等因素，仍然不能滿足生產(chǎn)一線的現(xiàn)場快速檢測的需求。
總體來說，免疫學(xué)檢測方法由于其快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設(shè)備，且對(duì)樣品純度要求不高等特性，特別適用于飼料廠進(jìn)行原料或成品的檢測。其基本原理是在合適的載體上，酶標(biāo)記抗體或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，在酶底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成為另一種帶色物的抗原和抗體的含量。該免疫學(xué)方法更實(shí)際，其靈敏度與TLC或HPLC法相當(dāng)，因而具有更廣闊的應(yīng)用前景。
該類方法有以下特點(diǎn)：1) 靈敏度高：免疫層析法檢出量可達(dá)ng級(jí)，ELISA 法最低檢出量可達(dá)pg級(jí)，并可定量測定。2) 干擾?。嚎贵w抗原的免疫反應(yīng)特異性很強(qiáng)，結(jié)構(gòu)類似物、熒光物質(zhì)、有色物質(zhì)對(duì)檢測的干擾很小。3) 操作簡便快捷：由于特異性強(qiáng)，簡化了樣品的預(yù)處理和提取純化過程，同時(shí)操作步驟也非常簡便，測定時(shí)間也短。4) 安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂貴的測定儀器，所用試劑也相對(duì)較少，特別是因?yàn)殪`敏度高，毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度可以很低，減少了對(duì)檢測人員和環(huán)境的潛在危害和污染。
三、國內(nèi)幾種真菌毒素檢測方法的研究進(jìn)展
3.1 黃曲霉毒素B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?。即含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀Ｇ罢邽榛径拘越Y(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。國內(nèi)最早研究真菌毒素免疫檢測方法的是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所的孫宗棠，他于1983年建立了AFB1單克隆抗體放射免疫測定方法。1992年，中國科學(xué)院上海細(xì)胞所李永鏞和上海醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院殷芬、俞順章等人合作建立了AFB1單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測方法。中國預(yù)防醫(yī)科院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所和江蘇微生物所也先后建立了AFB1多克隆抗體的酶聯(lián)免疫測定方法。北京市營養(yǎng)源研究所路戈與中國醫(yī)科院腫瘤研究所王德斌和衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所計(jì)融等人合作于1994年建立了規(guī)范的AFB1單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，該法已列為國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T5009.22－1996）。在1985年以前，另有幾種熒光色譜法列為國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T5009.23－1996;GB/T5009.24－1996）。其中薄層色譜法由衛(wèi)生研究所和青島商品檢驗(yàn)局于1973年建立（GB/T5009.22－1996）。
3.2 T－2毒素為劇毒（豬靜注LD50=1.2mg/kg），具有明顯的細(xì)胞毒，而且是體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的抑制劑，有致畸性和致突變性。中毒后嘔吐，腹瀉，嚴(yán)重時(shí)損傷造血組織。T－2毒素的免疫檢測方法由衛(wèi)生部食檢所陽傳和、羅雪云、計(jì)融于1991年建立（GB/T14933－94），方法最低檢出量為1ng/ml，敏感范圍為4－1000ng/ml。這是首次采用免疫技術(shù)建立的檢測真菌毒素的國家標(biāo)準(zhǔn)。
3.3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素，DON）是較早（1970年）被分離提純后命名的真菌毒素，毒性弱于T－2毒素，（小鼠經(jīng)口LD50=9.2mg/kg）中毒癥狀類似，有明顯的致吐作用。DON經(jīng)對(duì)甲基苯甲醛噴霧后呈黃色，衛(wèi)生部食檢所魏潤蘊(yùn)于1986年建立了DON薄層層析檢測方法（GB/T14929.5－1994）。DON免疫檢測方法由衛(wèi)生部食檢所陽傳和、計(jì)融于1992年建立，方法最低檢出量為5ng/ml，敏感范圍為5－1000ng/ml，該法已批準(zhǔn)為國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T14929.5－1994）。小麥、面粉、玉米及玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標(biāo)準(zhǔn)已于1996年9月1日頒布實(shí)施（GB16329－1996），最高允許量為1000μg/kg
3.4二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（DAS）的毒性強(qiáng)于T－2毒素（豬靜注LD50=0.367mg/kg），1992年，衛(wèi)生部食檢所李業(yè)鵬、羅雪云等用酶標(biāo)記單克隆抗體建立了檢測DAS的雙抗夾心酶免疫斑點(diǎn)檢驗(yàn)方法，最低檢出量為10ng/ml，敏感范圍為2－1000ng/ml。
3.5玉米赤霉烯酮（ZEN，F(xiàn)－2）是另外一種從赤霉病麥中分離出來的真菌毒素（化學(xué)名稱為6－（10－羥基－6－氧基碳烯基）－β－雷鎖酸－μ－內(nèi)酯，分子量為318），主要污染小麥、大米、玉米、蕎麥等谷物，是一種生殖系統(tǒng)毒素，有強(qiáng)烈致畸作用。ZEN在波長為254nm短紫外光照射下發(fā)出蘭綠色熒光，衛(wèi)生部食檢所羅雪云、胡霞于1992年建立ZEN薄層層析分析方法，最低檢出量為50μg/kg。1993年中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)所王景琳、張志東等建立了ZEN單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，最低檢出量為0.3ng/ml。1995年，北京市營養(yǎng)源研究所路戈等也建立了ZEN單克隆抗體免疫檢測方法，最低檢出量為1ng/ml，敏感范圍5－1000ng/ml，該法已通過國家標(biāo)準(zhǔn)審查。
3.6 赭曲霉毒素A（OA）主要表現(xiàn)為很強(qiáng)的腎臟毒（大鼠經(jīng)口LD50=20mg/kg）并有致畸性和致癌性，污染的谷物主要為麥類及玉米。在紫外光下赭曲霉毒素A呈綠色熒光，衛(wèi)生部食檢所于1991年建立了OA薄層層析分析方法，已列入國家標(biāo)準(zhǔn)（GB13111－91）。1992年該所陽傳和、羅雪云等又建立了OA單克隆抗體免疫檢測方法，也已經(jīng)被批準(zhǔn)為國家標(biāo)準(zhǔn)。
3.7 黃曲霉毒素M1（AFM1）是AFB1經(jīng)動(dòng)物代謝產(chǎn)生的衍生物，可以從內(nèi)臟、尿和乳汁中測出。尿或乳汁中排出的AFM1的量約為攝入AFB1量的1％。AFM1的毒性（鴨雛經(jīng)口LD50≈0.32mg/kg）僅次于AFB1，致癌性也相似。因此乳及乳制品中AFM1的污染控制是食品衛(wèi)生工作的重要環(huán)節(jié)。我國規(guī)定牛乳中AFM1的含量不得超過0.5μg/kg，乳制品按實(shí)際含乳量折算(GB9676－88)。1980年衛(wèi)生研究所胡文娟、韓玉蓮（AFM1在波長365nm紫外光照射下呈蘭紫色熒光）建立了檢測幾種主要?jiǎng)游镄允称分蠥FM1的薄層層析法，最低檢出量為0.1～0.5μg/kg（GB/T5009.24－1996）。1992年中國預(yù)防醫(yī)科院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所的劉興介等人利用美國威斯康星大學(xué)朱繁生教授提供的單克隆抗體應(yīng)用ELISA直接競爭法測定了97份乳粉樣品中的AFM1含量。（陽性率84.5％，超標(biāo)率39.2％，最高4.16ng/g）1996年，衛(wèi)生部食檢所李燕俊、計(jì)融開始研究AFM1的免疫檢測技術(shù)，目前主要工作已經(jīng)完成。
3.8雜色曲霉素（柄曲霉素，分子量324）是一種很強(qiáng)的肝及腎臟毒素。可導(dǎo)致膽管癌和肝癌，有致突變性，但對(duì)食品的污染頻率較低。雜色曲霉素經(jīng)三氯化鋁噴霧后加熱，可在365nm波長紫外光下呈黃色熒光。衛(wèi)生研究所建立的檢測雜色曲霉素的薄層色譜法已于1984年列為國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T5009.25－1996）。該法對(duì)大米、玉米、小麥的最低檢出量為25μg/kg，黃豆、花生為50μg/kg。
3.9展青霉素（PTL）有致癌性，也有致畸、致突變作用，在水果制品中的污染較為嚴(yán)重。1998年衛(wèi)生研究所劉勇、胡文娟建立了蘋果、山楂制品中展青霉素的薄層掃描測定法。該法于1994年列為國家標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)還規(guī)定了展青霉素的限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB14974－94）。1992年吳南建立了用高效液相色譜法測定展青霉素的方法，最低檢出量為2μg/kg。
3.10串珠鐮刀菌素（MF）屬劇毒物，有很強(qiáng)的心臟毒，中毒死亡后可見心肌壞死性病變，近年研究表明該毒素可能是克山病主因。串珠鐮刀菌廣泛污染糧食作物，其中對(duì)玉米的污染率較高。1984年，俞世榮、王玉華建立了串珠鐮刀菌素的薄層及高效液相色譜測定法。
四、對(duì)于飼料中現(xiàn)有霉菌毒素檢測技術(shù)的小結(jié)
因化學(xué)加工、人為添加而進(jìn)入食品中的有毒化合物所造成的危害是可以被預(yù)防的；而以食品的天然組分形式存在的天然霉菌毒素則不易被識(shí)別，且由于潛在毒性大，從而會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成更大的威脅。霉菌毒素是霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于化學(xué)污染物，對(duì)人和動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生非常嚴(yán)重的危害。拿黃曲霉毒素來說，含有黃曲霉毒素的食品被人誤食后容易出現(xiàn)肝臟病變，甚至導(dǎo)致肝癌；所以，對(duì)飼料、食品等原料開展霉菌毒素檢測是非常迫切需要解決的問題。
事實(shí)上，越早進(jìn)行霉菌毒素檢測就越容易將霉菌毒素產(chǎn)生的危害降到最低。如能從源頭就發(fā)現(xiàn)霉菌毒素，則便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的飼料給養(yǎng)殖業(yè)帶來危害，從而使企業(yè)包括食品安全蒙上陰影。實(shí)際操作中，如果在飼料原料采購環(huán)節(jié)就采用快速篩選的方法，查看飼料原料是否含有霉菌毒素，則可以使企業(yè)避免使用含霉菌毒素的原料生產(chǎn)飼料，或者在原料緊缺又必須生產(chǎn)的情況下，可以針對(duì)檢測結(jié)果采取有效的霉菌毒素處理技術(shù)，全面降低霉菌毒素的毒害性。而目前已有的無論是目測、TLC法或者HPLC法以及稱之為實(shí)驗(yàn)室快速檢測的ELISA試劑盒方法，都不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)于單一飼料原料和飼料成品的快速霉菌毒素污染程度的檢測，不是由于樣品數(shù)少就是實(shí)際成本過高無法承受或者就是檢測結(jié)果所需要的時(shí)間太長等原因，導(dǎo)致了檢測應(yīng)用嚴(yán)重受限，飼料利用、養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益都受到明顯影響，更加嚴(yán)重的是由于長期沒有可控制的直接指導(dǎo)數(shù)據(jù)，大多數(shù)飼料在到達(dá)養(yǎng)殖場以前幾乎沒有采取任何霉菌毒素的防治措施，動(dòng)物都處于慢性中毒的狀態(tài)中（根據(jù)2006、2007、2008及2009年度上半年的檢測數(shù)據(jù)表明，飼料及飼料原料中同時(shí)存在四種以上霉菌毒素污染狀態(tài)比率占到被抽檢樣品總數(shù)的49.1%（見圖2 檢測樣品中霉菌毒素污染情況比率），霉菌毒素污染已經(jīng)是作為一種常態(tài)而存在，一旦積累到動(dòng)物不能承受了則開始出現(xiàn)病癥，即使不發(fā)病，動(dòng)物內(nèi)臟中所積累的毒素含量也足可以通過食物鏈來影響到人類的健康，如牛奶中的黃曲霉毒素M1就是由飼料中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過生理代謝轉(zhuǎn)化而來，對(duì)牛奶的食用者來說危險(xiǎn)極大。一線的生產(chǎn)部門非常需要一種能夠在現(xiàn)場就開展檢測且不受樣品數(shù)量的限制，成本又不太高，又能夠把握住霉菌毒素污染程度的先進(jìn)實(shí)用的新檢測技術(shù)。

圖2  檢測樣品中霉菌毒素污染情況比率對(duì)比
因此，研制對(duì)霉菌毒素快速、高靈敏、高特異性的現(xiàn)場、廉價(jià)的可靠的檢測方法顯得尤為重要。高效液相色譜、質(zhì)譜檢測法，可做出精確定性定量測定，運(yùn)用恰當(dāng)甚至可測到各組分的含量，它們靈敏度高、選擇性強(qiáng)，有極好的發(fā)展前景，但是樣品前處理要求嚴(yán)格，標(biāo)準(zhǔn)品純度有一定的要求，而且儀器昂貴，測試人員往往還要進(jìn)行專門的培訓(xùn)，因此成本較高。所以，僅適合大型企業(yè)或?qū)z測靈敏度要求較高的科研院校、檢測機(jī)構(gòu)等單位使用。免疫學(xué)檢測方法尤其是酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏度高，干擾少，測定步驟簡便、快速，操作安全，設(shè)備投資少，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，非常適合實(shí)驗(yàn)室開展集中的樣品快速檢測，由于受到樣品數(shù)量、試劑盒特殊保存條件、毒素標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)以及酶標(biāo)儀操作要求的限制，無論檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和經(jīng)濟(jì)性，均不能滿足進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測的需求。
五、適合于飼料養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測霉菌毒素污染的新技術(shù)
在傳統(tǒng)檢測方法基礎(chǔ)之上，近年來發(fā)展了許多新的檢測方法，其中值得一提的是，最近建立的采用免疫學(xué)和分子免疫學(xué)原理，利用特異性抗體與抗原的反應(yīng)原理，開發(fā)一種現(xiàn)場的霉菌毒素檢測技術(shù)大受歡迎，這就是目前比較熱門的金標(biāo)試紙卡現(xiàn)場霉菌毒素快速檢測技術(shù)。霉菌毒素快速檢測試紙法應(yīng)用于飼料原料檢測，可以快速得到結(jié)果，為飼料、養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)對(duì)霉菌毒素潛在危害的處理提供事先的、直接的、相對(duì)合理的科學(xué)依據(jù)。當(dāng)原料快檢呈陽性結(jié)果時(shí)表明樣品中毒素的殘留限量在檢測設(shè)限值以上，當(dāng)原料快檢呈陰性結(jié)果時(shí)表明樣品中毒素的殘留限量在檢測設(shè)限值以下。目前此項(xiàng)技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)完全國產(chǎn)化，并擁有自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。
5.1 霉菌毒素現(xiàn)場快速檢測新技術(shù)
5.1.1主要原理
利用特定的抗原抗體反應(yīng)原理，采用實(shí)現(xiàn)包被的特異性抗體捕捉檢測對(duì)象中的對(duì)應(yīng)霉菌毒素成分，進(jìn)而通過觀察測試線和控制線的顯色反應(yīng)來達(dá)到判定檢測對(duì)象中的霉菌毒素污染程度的目的。如下圖結(jié)構(gòu)（圖3 金標(biāo)試紙卡的組成結(jié)構(gòu)圖）

圖3 金標(biāo)試紙卡的組成結(jié)構(gòu)圖
檢測反應(yīng)過程如圖4、圖5

圖4樣品檢測陰性反應(yīng)示意圖

圖5 樣品檢測陽性反應(yīng)示意圖

圖6 陰性、陽性檢測試紙反應(yīng)實(shí)物圖
5.1.2 快速檢測結(jié)果判定
該技術(shù)根據(jù)不同霉菌毒素的危害程度以及飼料原料和飼料中對(duì)各種動(dòng)物耐受限度的國標(biāo)要求，設(shè)定了不同的最低靈敏度值，就是說，只要滴入檢測液加液孔中的液體中被檢毒素的濃度超過的最低檢測靈敏度，則顯示陽性，反之則顯示陰性。根據(jù)這個(gè)道理，檢測人員可以在樣品前處理提取出毒素后，應(yīng)用專配的毒素檢測稀釋液進(jìn)行等倍數(shù)稀釋配置成最終的檢測液，繼而根據(jù)檢測結(jié)果推算出被檢樣品中毒素含量的基本范圍，從而對(duì)生產(chǎn)提供直接的指導(dǎo)意義。
5.2 幾種檢測方法的對(duì)比
作為一種新型的霉菌毒素快速檢測技術(shù)，國外和國內(nèi)基本上達(dá)到了同步，而且技術(shù)水平相當(dāng)，無明顯的差異，根據(jù)武漢糧食中心的驗(yàn)證結(jié)果表明（見表4、表5），黃曲霉毒素檢測結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果完全符合，赤霉烯酮的符合率也達(dá)到了94%以上，如果加上試紙法本身的誤差范圍，快速試紙檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性在95%以上是由保障的。其最重要的意義在于，對(duì)于一個(gè)生產(chǎn)型企業(yè)而非研究機(jī)構(gòu)的而言，對(duì)于霉菌毒素污染的狀況啟示只需要知道一個(gè)相對(duì)準(zhǔn)確的范圍就可以對(duì)生產(chǎn)提供直接的指導(dǎo)，根本不需要采用費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢、費(fèi)人的方法檢測出具體的含量。
除此之外，國產(chǎn)技術(shù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)品在成本上擁有完全的優(yōu)勢，與目前市售的試劑盒相比，具有快速、方便、便宜和現(xiàn)場性等特點(diǎn)，加上其成本只有進(jìn)口同類產(chǎn)品的40%左右，完全可以替代進(jìn)口產(chǎn)品。應(yīng)該說該技術(shù)具有很強(qiáng)的實(shí)用性，具有較高的推廣價(jià)值。該技術(shù)的應(yīng)用，必然能夠給我國飼料安全、食品安全增加一層強(qiáng)有力的保護(hù)層，為國家的經(jīng)濟(jì)建設(shè)做貢獻(xiàn)。
表4  快速檢測技術(shù)與傳統(tǒng)方法的對(duì)比

表5  快速試紙與試劑盒對(duì)比

表6黃曲霉毒素B1測試結(jié)果比較

表7 玉米赤霉烯酮測試結(jié)果比較

六、新型霉菌毒素快速檢測技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用
為了更好的在生產(chǎn)實(shí)際中使用好這個(gè)快速檢測技術(shù)，真正實(shí)現(xiàn)用最經(jīng)濟(jì)的檢測投入達(dá)到檢測目的，從而贏得在霉菌毒素污染問題解決中的空間與時(shí)間，各個(gè)生產(chǎn)單位技術(shù)人員需要從以下幾個(gè)方面來逐一規(guī)范，才能夠發(fā)揮快速檢測的作用。簡單的說就是一標(biāo)二告三測四判五定六選六個(gè)步驟，簡要分述如下：
6.1一標(biāo)---制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)
根據(jù)企業(yè)自身生產(chǎn)產(chǎn)品的特點(diǎn)以及動(dòng)物不同階段，參照國標(biāo)限值和動(dòng)物耐受限量指標(biāo)，首先制定本企業(yè)內(nèi)部的各類原料和成品中霉菌毒素含量的限值標(biāo)準(zhǔn)，即內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，這點(diǎn)非常重要，沒有標(biāo)準(zhǔn)品控人員將無法比判，如果本標(biāo)準(zhǔn)制定不合理，判斷的結(jié)果將和生產(chǎn)實(shí)際產(chǎn)生較大誤差，會(huì)對(duì)生產(chǎn)實(shí)際產(chǎn)生指導(dǎo)偏差，那么會(huì)大大降低快速檢測技術(shù)的價(jià)值。建議各個(gè)單位應(yīng)該多搜集相關(guān)資料和標(biāo)準(zhǔn)，緊密結(jié)合自身的產(chǎn)品生產(chǎn)需要來制定。
6.2二告---告知供應(yīng)商、采購、品控
    即將經(jīng)過論證制定的霉菌毒素內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行備案，并告知原料供應(yīng)商、采購部、品控部，便于進(jìn)行統(tǒng)一管理。標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)后要快速告知相關(guān)環(huán)節(jié)，尤其是企業(yè)內(nèi)部的品控和采購人員，否則容易產(chǎn)生誤會(huì)和工作上的摩擦，不利于正常的工作開展。
6.3三測---依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢測
檢測人員按照企業(yè)技術(shù)部擬定的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行快速檢測，并進(jìn)行快速的判斷。只要擁有了標(biāo)準(zhǔn)，品控人員就可以利用本技術(shù)快速的測定結(jié)果。
6.4四判---根據(jù)檢測結(jié)果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)判定合格與否
根據(jù)檢測的結(jié)果并對(duì)照內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，快速判斷被檢對(duì)象是否符合安全控制標(biāo)準(zhǔn)。檢測過程中一定要嚴(yán)格按照操作有關(guān)要求并注意細(xì)節(jié)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。
6.5五定---制定解決應(yīng)對(duì)方案
根據(jù)判定結(jié)果，參照原料的實(shí)際使用狀況和毒素吸附劑產(chǎn)品的功能特點(diǎn)，由品控部提出初步的解決方案，技術(shù)部進(jìn)行最后的裁定。
6.6六選---選擇合適的脫毒產(chǎn)品
需要使用毒素吸附劑進(jìn)行脫毒時(shí)，則根據(jù)技術(shù)部門制定的解決方案聯(lián)系合適的產(chǎn)品供應(yīng)廠商，在生產(chǎn)飼料時(shí)添加使用。
七、小結(jié)
霉菌毒素的污染盡管已經(jīng)非常嚴(yán)重，但是我們畢竟已經(jīng)研究了多種應(yīng)對(duì)的方法，只要能夠在使用含有霉菌毒素的原料之前快速得到污染數(shù)據(jù)或者污染程度的判斷，我們就可以采取有效的積極的應(yīng)對(duì)措施，將霉菌毒素的危害降到更低，從而保障飼料、養(yǎng)殖的健康發(fā)展。從這點(diǎn)上說，金標(biāo)抗體快速檢測試紙技術(shù)的及時(shí)推出，必然能夠?yàn)檎麄€(gè)飼料養(yǎng)殖行業(yè)早日擺脫“霉毒”的困擾做出較大貢獻(xiàn)，對(duì)于飼料中其他物質(zhì)含量的快速檢測技術(shù)研發(fā)也具有重要的啟發(fā)和參考作用。

作者及單位聯(lián)系方法：
徐超   上海澳靈生物科技有限公司  技術(shù)總監(jiān)   
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yaoyuyuan

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qdwelly

:tiaotiao:好資料，謝謝