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zhangwei371 · 發(fā)表于 2010-5-18 10:15:39

我國動物微生態(tài)產(chǎn)業(yè)存在的問題與發(fā)展對策

時間： 2009-11-24 8:36:04 【字體：大中小】【打印】【關閉】

中國農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)學國家重點實驗室/張日俊

動物微生態(tài)學的發(fā)展，使人們對動物腸道微生物菌群的作用有了更深刻和更廣泛的認識；同時，由于在畜禽養(yǎng)殖業(yè)和飼料中長期地、過量地和不合理地使用或濫用抗生素，出現(xiàn)了一系列問題，如引起動物體內(nèi)菌群失調(diào)或紊亂或條件性致病菌異位轉移、多重耐藥性菌株產(chǎn)生(Alanis, 2005)以及在畜禽產(chǎn)品(如肉、蛋、奶)中的殘留和環(huán)境污染等，特別是抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhoea)、耐藥性艱難梭菌腹瀉(drug-resistance Clostridium difficile-associated diarrhea)和耐藥性過路菌腹瀉(如環(huán)境中的耐藥性大腸桿菌、沙門氏菌等)，正嚴重危害著畜牧業(yè)的健康發(fā)展，導致用藥無效或用藥量增加，惡性循環(huán)。同時，由于廣泛的耐藥細菌引發(fā)的感染也是21世紀嚴重危害人類健康和安全的重大問題之一。為此，國內(nèi)外科學界和產(chǎn)業(yè)界都在積極探索和尋找抗生素替代品，這包括微生態(tài)制劑(Microecological preparation)又稱直接飼喂的微生物(Direct-fed microbials，DFMs)或益生素(Probiotics)或微生物飼料添加劑(microbial Additive)或微生態(tài)調(diào)控劑(Microecological modulator)以及益生元(Prebiotics)、植物提取物(Plant extract)、生物活性肽(Bioactive peptide)或抗菌肽(Antimicrobial peptide)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulator)等，縱觀國內(nèi)外的發(fā)展情況，微生態(tài)制劑將會成為抗生素替代品的主力軍(Trafalska and Grzybowska, 2004; Valentine, 1955)，而且目前市場上微生態(tài)制劑的品種也越來越多，從菌種品質上講，可謂是優(yōu)劣混雜；從劑型上看，有液劑、粉劑、半干半濕粉等；活菌標示值上，也是高高低低，真假難分；菌種安全性上也缺乏認真的評價。因此，為了使消費者對微生態(tài)制劑的品質、優(yōu)劣等有更深刻和全面的了解，為了推動我國建立微生態(tài)制劑的規(guī)范和標準，本文將重點闡述國內(nèi)微生態(tài)產(chǎn)業(yè)在菌種安全性、產(chǎn)品功能性和生產(chǎn)加工技術等方面存在的一些問題、國外同類產(chǎn)品的評價標準和解決我國益生素產(chǎn)品現(xiàn)存問題的對策，以便使微生態(tài)產(chǎn)業(yè)得到良性發(fā)展，為我國的食品安全作出重要貢獻。

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畜禽腸道微生物菌群有著重要的生物學功能，實施有益的調(diào)控，可促進其生長發(fā)育、營養(yǎng)物質的消化吸收和改善健康狀況，從而減少抗生素的用量，提高我國的食品安全。

動物自出生后就立即處于微生物世界的包圍中，機體凡與外界接觸及相通的部位皆有微生物的存在。在非反芻動物的胃腸道(Gastrointestinal tract,GIT)棲息著300～500種的微生物被稱為微生態(tài)系統(tǒng)(Microbial ecosystems)，包括需氧或厭氧的細菌、真菌和酵母等，每克腸內(nèi)容物中的微生物數(shù)量高達1010～1011個，超過機體細胞總數(shù)的10倍，這些胃腸道微生物(Gastrointestinal microbiota)群系之間及微生物與動物之間形成了相互依存、相互作用的不可分割的整體，參與了動物體的生長、發(fā)育、消化、吸收、營養(yǎng)、免疫、生物拮抗及其各種功能和結構的發(fā)生、發(fā)展和衰退的全過程。消化道正常微生物菌群(Normal microflora/microbiota)可根據(jù)其作用分為三類：①共生性細菌：是主要菌群(＞90%)，主要指專性厭氧或兼性厭氧菌如乳酸菌和雙歧桿菌，這類生理性細菌數(shù)量大，恒定存在，對機體有益無害，在維持消化道微生態(tài)平衡上起著重要作用，同時，起著提供或豐富營養(yǎng)、促進消化、刺激免疫和消除腸內(nèi)毒素等作用。共生菌與腸上皮密切接觸，其生理和代謝活動與細胞的生理和代謝活動密切相關，甚至融為一體。這類細菌可以自營同時又可利他(宿主)，細菌將復雜的碳水化合物(纖維素或非淀粉多糖)發(fā)酵成為乳酸或揮發(fā)性脂肪酸(如丙酸)。乳酸在腸道形成酸性環(huán)境，對其它致病菌可產(chǎn)生“競爭排除作用”，但乳酸堆積多也會刺激腸道蠕動，使腸道內(nèi)容物排空加快。②機會性細菌：約占10%，包括無病原性的大腸桿菌、鏈球菌及腸球菌等。這些機會性細菌視腸道環(huán)境而改變停留在腸道的數(shù)量及時間。③致病性細菌：含量極少(＜0.01%)的致病性菌群，包括梭菌、葡萄球菌、偽單胞菌、病原性大腸桿菌、沙門氏菌以及部分真菌。這類菌群不僅具有致病性，同時他們也會消耗宿主的能量，而其發(fā)酵產(chǎn)物(如氨氣、H2S等)也可能對宿主有害，還導致體內(nèi)腐敗物、致癌物及毒素的增加。正是動物腸道中的大量微生物與其所處的微環(huán)境構成了“微生態(tài)三角”，即在宿主遺傳的控制下，正常微生物菌群、免疫與營養(yǎng)構成的相互依賴、相互制約的關系。正常的微生物菌群的生理功能是動物生存必需的一個生理系統(tǒng)，動物是動物真核細胞和細菌原核細胞構成的綜合體，微生態(tài)系統(tǒng)是除骨骼、肌肉、神經(jīng)、附屬(皮、毛、指或趾甲)、淋巴(免疫)、呼吸、消化、內(nèi)分泌、心血管、泌尿、雄性和雌性生殖系統(tǒng)(Morieb,1995)之外的第十三個生理系統(tǒng)。第十三系統(tǒng)發(fā)揮著一系列重要的作用：①胃腸菌群促進胃腸黏膜細胞的發(fā)育和成熟(解剖修飾作用)；②腸粘的菌群屏障作用；③口服耐受性和激活免疫系統(tǒng)，促進免疫細胞成熟，包括B細胞、T細胞、M細胞及吞噬細胞、體液免疫、細胞免疫、產(chǎn)溶菌酶細胞等；④產(chǎn)生多種消化酶，促進營養(yǎng)消化、吸收和代謝，包括對蛋白質或氮素、脂類、碳水化合物、維生素、無機鹽和黏液代謝等；⑤胃腸菌群產(chǎn)生遷移傳動復合物(migrating motor complexes,MMC),刺激腸蠕動；⑥代謝產(chǎn)酸，酸化腸道環(huán)境，活化酶系統(tǒng)和抑制偏堿性有害微生物的生長。動物的微生態(tài)系統(tǒng)就是通過上述多種作用，最終產(chǎn)生抑制有害菌群，增強免疫功能，防治疾病，提高飼料營養(yǎng)素的消化吸收和轉化效率，促進動物產(chǎn)品(肉、蛋、奶、毛、皮等)的形成和品質改善。可見，胃腸道微生物存在復雜的多樣性，因此表現(xiàn)出菌群和功能的多樣性。動物體內(nèi)各種微生物的組成和結構(比例)直接影響其生命活動向或好或壞的方向發(fā)展。因此，對胃腸道微生物進行調(diào)控有著重要的實踐意義。

微生態(tài)制劑又稱益生素(Probiotics)是一種重要的腸道菌群調(diào)節(jié)劑，傳統(tǒng)概念認為，益生素是指攝入動物體內(nèi)參與腸內(nèi)微生態(tài)平衡的具有直接通過增強動物對腸道有害微生物的抑制作用，或者通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，而間接起到促進動物生長作用和提高飼料轉化率的活性微生物培養(yǎng)物。1994年在德國舉行的國際會議上，各國微生態(tài)學家在總結該學科近些年研究成果的基礎上，給益生素賦予了新的內(nèi)涵，一致認為，益生素是含活菌和(或)死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細菌制品，經(jīng)口或經(jīng)由其它粘膜途徑投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機制。這個概念能更加準確、全面地概括益生素的組成和功能。對腸道菌群的調(diào)控有著重要的作用，主要包括：①對營養(yǎng)物質消化吸收利用條件的重建；②免疫力或抗病力的重建；③生長條件的重建。

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飼料安全、人類的食品安全和健康需要微生態(tài)制品

近年來的大量研究表明，人類常見的健康問題如癌癥、畸形、抗藥性和某些中毒現(xiàn)象與肉、蛋、奶中的抗生素、激素和其它合成藥物的殘留有關，從而促使各國紛紛立法限制和禁用抗生素、激素等添加劑在飼料中的使用，如歐盟農(nóng)業(yè)委員會立法從1999年7月1日起禁止在飼料中添加桿菌肽、螺旋霉素、維吉尼亞霉素、泰樂菌素4種抗生素；2003年1月歐盟農(nóng)業(yè)委員會立法到2006年1月全面禁止目前仍然使用的4種飼用促生長抗生素，即黃霉素、莫能霉素、鹽霉素和卑霉素。與此同時，益生素以其綠色安全、無毒副作用、無殘留的優(yōu)點而備受飼料生產(chǎn)企業(yè)和畜牧養(yǎng)殖者的青睞，并得到廣泛應用。益生素作為一種抗生素替代品，在發(fā)展綠色畜牧業(yè)、提高飼料和食品安全、促進人類健康方面有著重要的作用。

但是，目前國內(nèi)微生態(tài)制劑正處于發(fā)展階段，由于各生產(chǎn)廠家生產(chǎn)工藝不一，造成產(chǎn)品質量參差不齊，再加上用戶選擇和使用不當，而出現(xiàn)使用效果不同、褒貶不一的局面，影響了微生物作為抗生素替代飼料添加劑的發(fā)展。這樣不利于我國微生態(tài)制劑(益生素類)產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

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國內(nèi)益生素制劑現(xiàn)存的主要問題及國外的評價標準3.1 菌種(菌株)選用不規(guī)范或變異性較大3.1.1
益生素菌種屬、種、株(Genus/species/strain)

菌種是微生態(tài)制劑生產(chǎn)的關鍵，也是微生態(tài)制劑質量的直接和重要保證。各國對作為益生素的菌種(菌株)都有明確規(guī)定，如1989年美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協(xié)會(AAFCO)公布了43種“可直接飼喂且通常認為是安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)”作為微生態(tài)制劑的出發(fā)菌株，主要有細菌(bacteria)、酵母(yeast)和真菌(fungi)，其中乳酸菌28種(包括乳酸桿菌12種、雙歧桿菌6種、鏈球菌6種、片球菌3種、明串珠菌1種)、芽孢桿菌5種、擬桿菌4種、曲霉2種、酵母菌2種等。其中，①乳酸桿菌屬(Lactobacilleae)12種：短乳桿菌(L. Brevis)、嗜酸乳桿菌(L. Acidophilus)、保加利亞乳桿菌(L. Bulgaricus)、干酪乳桿菌(L.Casei)、纖維二糖乳桿菌(L. Cellosus)、彎曲乳桿菌(L. Curvatus)、德氏乳桿菌(L. Delbruekii)、發(fā)酵乳桿菌(L. Fermentum)、羅特氏乳桿菌(L. Reuterii)、乳酸乳桿菌(L. lactis)、植物乳桿菌(L. Plantarum)。②雙歧桿菌屬(Bifidobactirium)6種：青春雙歧桿菌(B. adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)、動物雙歧桿菌(B. animalis)、長雙歧桿菌(B. longum)、嗜熱雙歧桿菌(B. thermophilum)、兩歧雙歧桿菌(B. bifidum)。③腸球菌屬(Enterococcus)2種：糞腸球菌(E.faecalis)又稱糞鏈球菌(S. faecium)、屎腸球菌(E.faecium)又稱屎鏈球菌(S. faecium)。④鏈球菌屬(Streptococcus)5種：嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)、乳酸鏈球菌(S. lactis) 又稱乳酸乳球菌(L.lactis)、中間型鏈球菌(S. intermedius)、乳脂鏈球菌(S. cremoris)、二丁酮鏈球菌(S. diacetylactis)。⑤芽孢桿菌屬(Bacillus)5種：凝結芽孢桿菌(Bacillu coagulans)、緩慢芽孢桿菌(B. lentus)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniforms)、短小芽孢桿菌(B. pumilus)。⑥明串珠菌屬(Leuconostoc)1種：腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。⑦片球菌屬(Pediococcus)3種：乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(P. cerecisiae)、戊糖片球菌(P. pentosaceus)。⑧乳球菌屬(Lactococcus)1種：乳酸乳球菌(L.lactis)又稱乳酸鏈球菌(S. lactis)。⑨丙酸桿菌屬(Propionibacterium)2種：謝氏丙酸桿菌(P.shermanii)、費氏丙酸桿菌(P. Freudenreichii)。⑩擬(類)桿菌屬(Bacteroides)4種：豬擬(類)桿菌(B. suis)、瘤胃生擬(類)桿菌(B. ruminocola)、多毛擬(類)桿菌(B. Capillosus)、嗜淀粉擬(類)桿菌(B. amylophilus)。酵母菌屬(Yeast)2種：啤酒酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)。曲霉菌屬(Aspergillus)2種：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A. oryzae)。

我國農(nóng)業(yè)部1999年6月公布(105號公告)了可以直接調(diào)喂動物的飼料級微生物添加劑菌種有12個：干酪乳桿菌( Lactobacillus casei)、植物乳桿菌(L．Planetarium)、嗜酸性乳桿菌(L．Acdophilus)、糞鏈球菌(Straptoccus
faecium)、乳鏈球菌(S．Lactis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(B．natto)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒酵母(Sacchace
cerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。

FAO/WHO《關于食用微生物選用評價規(guī)則》(FAO/WHO, 2002)指出，食用微生物的菌株必須通過表型和基因型的鑒定，并通過體外和動物試驗證明有明確的功能和良好的安全性，還要通過1期臨床試驗。

1989年美國FDA把傳統(tǒng)上通稱的益生素定義為可直接飼喂的微生物(Direct-fed microbials, DFMs)，這些微生物菌種應具有以下特性：①產(chǎn)生有機酸，如乳酸、乙酸、甲酸等，這些酸能夠抑制病原微生物，也可作為動物的能量或對其他微生物有益；②產(chǎn)生抗菌物質，如細菌素、過氧化氫或其他化合物抑制病原微生物；③有益微生物粘附占位，競爭排除，防止病原微生物定植；④刺激免疫反應，增加免疫系統(tǒng)活力；⑤產(chǎn)生各種消化酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和糖苷酶(glycosidases)，提高飼料利用效率，此外雙歧桿菌還產(chǎn)生DNA聚合酶可修復機體損傷的細胞；⑥減少毒胺的產(chǎn)生，中和內(nèi)毒素。

3.1.2
益生素菌種的選擇標準

1992年R.Fukker提出作為益生素的菌種應符合以下標準：①微生物必須是大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的活菌制劑；②在保藏和使用期間，應保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)；③必須能在人體腸道中存活；④必須對宿主產(chǎn)生有益作用；⑤應是人體腸道正常菌群的成員(具有調(diào)節(jié)和有益作用的外來菌也可以)。

目前國內(nèi)有些廠家的菌種(菌株)實際并沒有嚴格按照微生物的標準進行篩選。有些同一名稱種屬下的菌株可能存在很大差異，雖然有些菌種“名稱”相同，如都是乳酸菌或酵母菌或芽孢桿菌或雙歧桿菌，但是由于同名菌種的不同菌株的生理特性(如生長快慢、最佳生長溫度、所需生長環(huán)境或條件、世代間隔、代謝產(chǎn)物等)和功效性存在較大差異，最終表現(xiàn)的功效也會有明顯不同。由于這方面的差別，導致含有相同名稱菌株的益生素產(chǎn)品，表現(xiàn)出明顯不同的功效，這如同不同人與人之間的能力、本領、財富等方面有天壤之別一樣。因此，生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種必須經(jīng)過嚴格篩選，這是生產(chǎn)出高質量的微生態(tài)制劑的關鍵。

3.2 菌種的安全性評價缺乏系統(tǒng)的證據(jù)

國內(nèi)有關微生物的安全性試驗研究較少，多數(shù)試驗廠家僅研究了微生態(tài)制劑的產(chǎn)品功效，測定指標為動物日增重、飼料轉化率、腸道微生態(tài)的影響和宿主發(fā)病率和死亡率評價，而對宿主、畜產(chǎn)品和人類食物鏈的安全評價試驗很少。為了人類自身安全、食品安全和環(huán)境污染應更多關注微生物安全性研究。

3.2.1
菌種安全性

作為飼料添加劑的菌種(菌株)應經(jīng)過嚴格的病理與毒理試驗，證明無毒、無致畸、無耐藥性、無藥殘等副作用。一株現(xiàn)在無毒副作用的菌種，將來也可能會因為理化、微生物毒素和菌種本身原因引起負性突變，所以應定期對生產(chǎn)菌種進行安全性檢測或評價(Sipsas et al.,2002; Sorokulova et al., 2006; Zhou et al.,2000)。檢測項目包括：藥物抗性試驗、質粒檢測、急性和亞急性毒性試驗、致癌性試驗、半致死量試驗、毒物酶類產(chǎn)生試驗、代謝產(chǎn)物分析試驗(Saarela et al.,2000; Saavedra et al.,2004)。

3.2.2
潛在致病性研究和感染能力的檢測

有益微生物在體內(nèi)正常微生態(tài)條件下，對其宿主動物具營養(yǎng)作用，但在某些條件下可能產(chǎn)生致病性，如近幾年有關乳酸桿菌引起臨床感染的報道。因此，使用微生態(tài)制劑時應綜合考慮動物健康狀況及其它因素以確保安全。

沒有致病性、感染性應該是微生物安全性必須具備的條件(Saarela et al.,2000)。要證明微生物是否具有感染性很困難，特別是厭氧菌。對弱感染力的細菌，即使給健康動物大量口服也不會引起感染。一般采用抗生素脫污染或口服免疫抑制劑等方法，造成動物的菌群屏障功能和免疫功能喪失，再喂給微生態(tài)制劑，檢查其是否引起感染。另外，采用無菌動物或悉生動物檢查微生物的感染。

3.2.3
菌種攜帶抗生素抗性基因的可能性

在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用抗生素，使攜帶抗生素抗性基因的微生物得以繁殖，而微生物的抗性基因一般存在質粒上，質粒是游離于染色體外的小分子遺傳物質，且有很高的遷移性（飄移），容易在不同微生物間傳遞，抗性基因也隨之轉移，這對人畜危害很大。作為益生素的菌株不得攜帶抗生素抗性基因(Saarela et al.,2000)。因而，研制和開發(fā)安全性高的、無耐藥性的微生物制劑，是涉及人類安全與生態(tài)環(huán)境的重大問題。

3.2.4
環(huán)境破壞的可能性

某些菌種的大量應用，通過動物排泄到周圍環(huán)境中，形成優(yōu)勢菌種，可能對改變周邊微生態(tài)系統(tǒng)，對其是否造成危害應長期監(jiān)測觀察。

目前國內(nèi)的問題是，不少廠家的微生態(tài)制劑缺乏潛在致病性和感染力檢測，同時，國家也沒有制訂相應的檢測標準和方法。就上述4個方面而言，國內(nèi)僅規(guī)定要做急性、亞急性毒性試驗，其他安全指標(即3.2.2～3.2.4)均沒有指定要測試。

3.3 對菌種的功效評價指標單一，簡單粗糙，缺乏系統(tǒng)性

目前國內(nèi)有關微生物功效的報道僅局限在產(chǎn)品試驗效果的觀察上，更應對微生物的作用機理應作系統(tǒng)研究。

3.3.1
功效性

評價微生物的功能至少應包括：益生菌對免疫調(diào)控作用、對腸道菌群的調(diào)控、對腹瀉的防治能力、對宿主生理功能(如生產(chǎn)性能)及飼料利用率的影響(Saarela et al., 2000)。

3.3.2
抗逆性

研究不同微生物在體內(nèi)外抵抗胃酸能力、抵抗膽汁酸鹽和耐受一定加工溫度(70～90℃)的能力。微生物耐酸力與抗膽鹽能力進行體內(nèi)試驗難度太大，現(xiàn)多用體外試驗作為評估菌株的耐酸性的相對參考標準(Tuomola et al.,2001)。

3.3.3
定植粘附能力

微生物在腸壁上的黏附是微生物定植過程中的一個重要步驟，是大量繁殖變成優(yōu)勢種群的前提，粘附能力與抗腹瀉、免疫力、競爭排斥及其他有益作用密切相關, 目前用體外試驗來研究和測定(Nemcova,1997; Saarela et al.,2000)。而菌株的黏附力在不同的環(huán)境會發(fā)生變化，同一菌株體外模型不同黏附情況不同，即使同一菌種的不同菌株對同一模型的黏附能力也是不同的(Lehto和Salminen,1996)。

3.3.4
穩(wěn)定性

益生菌在飼料產(chǎn)品中活菌的生物學特性、遺傳學特性應該穩(wěn)定，在使用和貯存期間，應保持穩(wěn)定的活存狀態(tài)。

在上述4個方面，國內(nèi)的問題表現(xiàn)比較突出。一些企業(yè)僅重視功效性試驗，而沒有進行穩(wěn)定性試驗、定植粘附能力和抗逆性試驗。這給一些研發(fā)能力弱、生產(chǎn)水平低下的企業(yè)帶來了可趁之機，以致于生產(chǎn)出來的產(chǎn)品表現(xiàn)出穩(wěn)定性差、批與批之間功效差別較大的問題，也影響了消費者對這類產(chǎn)品的信任度。

3.4 菌株的來源和保存條件不合理

微生態(tài)制劑不同于其它飼料添加劑，它是繁殖和變異很快的活的生物體，對其來源、保存與利用都應有嚴格的規(guī)范和操作程序?！?/font>

①菌種來源：菌種來源歷史應清楚，以專門機構審查認可并同意，方可用于生產(chǎn)。保存和分發(fā)也應由專門機構負責或由研制單位專門管理部門保存和分發(fā)。

②菌種保存與利用：生產(chǎn)用菌種應先制成凍干粉，即在菌種管中冷凍干燥一大批，并保存于2℃～3℃以備生產(chǎn)使用。

③凍干菌種檢定合格后才可投產(chǎn)，生產(chǎn)程序為：凍干粉→液體活化→搖瓶→一級種子瓶或二級種子→生產(chǎn)罐發(fā)酵。

④菌種傳代不應超過5代，因過多過傳代易造成細菌某些生物特性變異。

⑤生產(chǎn)用菌種要求長期延續(xù)保持原有特性，菌種必須專人管理，經(jīng)常定期檢查，并應建立菌種檔案資料，包括來源、歷史、篩選、檢定、凍干保存、數(shù)量、啟開使用等完整的記錄，這些都須專門管理部門專門人員承擔。

3.5 生產(chǎn)加工技術不夠合理和科學

目前國內(nèi)有些微生物生產(chǎn)廠家設備簡單，問題較多，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

①生產(chǎn)用的菌種來源不規(guī)范。一些廠家所用的菌種不是祖代經(jīng)冷凍干燥保藏的菌種，而是原種經(jīng)多次傳代的菌種，是否已經(jīng)產(chǎn)生變異并不清楚；或通過搖瓶后直接接種到并沒有滅菌的固體培養(yǎng)介質上放大生產(chǎn)，或任意比例放大生產(chǎn)，導致產(chǎn)品中雜菌嚴重超標，甚至雜菌占據(jù)了優(yōu)勢，以致于使用此類產(chǎn)品后沒有明顯的功效。

②多菌種任意混合，生產(chǎn)微生物添加劑。如目前國內(nèi)生產(chǎn)的益生素制品含有5科10屬80多種微生物，其菌種也未經(jīng)過鑒定和安全性評價，使用此類產(chǎn)品存在潛在的風險。建議益生素生產(chǎn)企業(yè)在復合菌制劑時，要進行科學合理的設計，使用什么樣的菌種、用幾個、如何進行工藝控制等都要周密考慮。

③生產(chǎn)工藝簡單，質量控制不嚴。目前的生產(chǎn)工藝流程主要有固體發(fā)酵、液-固發(fā)酵(即先進行液體發(fā)酵，然后接種到固體培養(yǎng)基上放大發(fā)酵)和液體發(fā)酵幾種生產(chǎn)工藝。

固體表面發(fā)酵法：是把固體表面培養(yǎng)物與載體按比例混合經(jīng)干燥制成，此法生產(chǎn)的產(chǎn)品目標微生物的含量低，易受雜菌污染，質量難以控制，不適于工業(yè)化生產(chǎn)，但投資少。這是目前大部分微生物生產(chǎn)廠家所采用的方法，也是目前影響微生態(tài)制劑推廣應用的主要不利因素。

應采取的正確工藝路線是液體深層高密度發(fā)酵，即：祖代菌種凍干粉→活化→純化→接種搖甁→一級種子或二級種子(在發(fā)酵罐中進行)→生產(chǎn)罐發(fā)酵→發(fā)酵液→后加工(或噴霧干燥、或濃縮后冷凍干燥、或載體吸附干燥、或微膠囊包被)→篩分→質檢→微生態(tài)產(chǎn)品。此法適于工業(yè)化生產(chǎn)，便于無菌操作，但成本高，生產(chǎn)過程能夠嚴格控制，目標菌(有效菌)含量高，雜菌少，菌種純度高，功效明確，也是技術和資金力量較強的企業(yè)采取的生產(chǎn)工藝。例如，由中國農(nóng)業(yè)大學承擔完成的國家“863”高技術計劃和農(nóng)業(yè)“跨越計劃”——“安全高效微生物飼料添加劑‘益生康’中試放大產(chǎn)業(yè)化和應用技術”就是應用這種技術方案。一些發(fā)達國家和地區(qū)如美、日、歐等生產(chǎn)的高品質微生態(tài)制劑也是如此。

生產(chǎn)工藝條件對質量很大影響, 如發(fā)酵溫度和時間會影響產(chǎn)品的質量，干燥工藝和溫度和時間會影響微生物的存活率和活性。例如，使用嗜酸乳酸桿菌，在37℃培養(yǎng)12h與32℃培養(yǎng)48h的同一出發(fā)菌株，其終端代謝產(chǎn)物和作用效果有很大不同。

④干燥方式不科學。干燥過程最易引起菌種存活率降低，目前常用的干燥方式為噴霧干燥和冷凍干燥。

噴霧干燥導致菌種的存活率偏低，大多數(shù)嗜溫菌的存活率僅為10%，某些乳酸菌的存活率為44%。冷凍干燥由于是在低溫下進行，可提高存活率，絕大多數(shù)菌種均可通過冷凍干燥而保存。

⑤產(chǎn)品包裝和劑型不規(guī)范　

由于大多數(shù)微生態(tài)制劑對空氣中的氧敏感,因而應選用密封防潮性能好的包裝材料。塑料薄膜因其透氣性、透濕性、化學穩(wěn)定性和耐熱性較差,不宜作為微生物的包裝材料,而應選用密封防潮性能好的鋁箔或高質量密封好的無毒塑料甁的作為包裝材料。

劑型以微膠囊和雙層膠囊為理想，其它如粉狀和粒狀都不耐加工和貯存。

隨著微囊工藝、緩釋技術和基因工程等新技術的發(fā)展, 這些新技術也將在微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)中得到廣泛應用。

3.6 微生態(tài)產(chǎn)品標示不明確或標示值(label claims)與實際含量(actual contents)不符

微生態(tài)產(chǎn)品應明確標示產(chǎn)品相關信息，包括：

菌種名稱：標準的中文菌種名稱、拉丁文菌種名稱以及菌種來源。

有效菌數(shù)和活力：產(chǎn)品應標示在產(chǎn)品保質期內(nèi)的有效菌數(shù)即產(chǎn)品標示值(label claims)或保證值，即微生態(tài)制劑中能添加飼料中有效活菌數(shù)(指每克成品當中所含有的有效活菌數(shù)量)。國內(nèi)一些益生素產(chǎn)品的實際活菌數(shù)遠遠低于其標示值，問題比較突出。在國外，南非的Elliot and Teversham(2004)評價了9個從美國和歐洲進口的益生素產(chǎn)品，結果發(fā)現(xiàn)僅有5/9產(chǎn)品的標示值與實測值相符，3/9的產(chǎn)品標示的菌種與實際相符。

此外，還包括產(chǎn)品功效、配伍禁忌、使用方法、產(chǎn)品保質期、生產(chǎn)日期等。

4
對國內(nèi)微生態(tài)行業(yè)的幾點建議

如前所述，隨著抗生素的負面影響暴露的越來越多，微生態(tài)制劑必將在替代抗生素、提高飼料和食品安全等方面發(fā)揮重要作用。但是，微生態(tài)產(chǎn)業(yè)目前存在一系列問題，為了促進微生態(tài)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和發(fā)揮其優(yōu)勢作用，提出如下建議，以供本行業(yè)和政府部門參考。

4.1 盡快建立有關產(chǎn)品標準

國家有關部門盡快建立飼用微生物和微生物飼料添加劑質量監(jiān)督檢驗測試中心，組織專家建立有關微生態(tài)產(chǎn)品標準、生產(chǎn)工藝標準，這是國家對微生態(tài)制劑實行監(jiān)督的準繩，也是國家對微生態(tài)制劑生產(chǎn)和質量的最低要求。微生物標準化是組織微生物生產(chǎn)和提高制品質量的重要手段,在飼料添加劑行業(yè)標準尚未建立之前，可參照FAO/WHO制訂的評價標準《Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food》或國內(nèi)醫(yī)藥行業(yè)《生物制品試行規(guī)程》，它是我國生物制品的國家標準和技術法規(guī)，包括生產(chǎn)和檢定的技術指標。它來源于生產(chǎn)，反過來又指導生產(chǎn)，不但規(guī)定了生產(chǎn)和檢定技術指標，還對原材料、工藝流程、檢定方法等作了詳細的規(guī)定，對制品質量起到保證作用。

4.2 政府部門加強市場監(jiān)督

政府有關部門通過加強對飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)的管理，對生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)條件應嚴格按獸藥生產(chǎn)規(guī)定和符合GMP標準。

嚴格把好微生物產(chǎn)品批準文號的審批關，要求生產(chǎn)企業(yè)提供產(chǎn)品的詳細資料，如菌種的來源和篩選、菌株的誘變、菌株配伍以及產(chǎn)品的毒理學和流行病學研究的資料。對企業(yè)的產(chǎn)品生產(chǎn)和研發(fā)過程中進行安全監(jiān)控，并嚴厲打擊假昌偽劣產(chǎn)品產(chǎn)品流入市場。

4.3 微生態(tài)制劑生產(chǎn)企業(yè)盡快生產(chǎn)出標示規(guī)范、安全高效的名優(yōu)產(chǎn)品，占領和引導市場。

企業(yè)應根據(jù)微生態(tài)制劑的法定標準和自身的生產(chǎn)工藝制定高于法定標準的內(nèi)控標準。嚴格按照制定的標準對原輔料、包裝材料、中間體、半成品和成品進行檢驗。加強生產(chǎn)過程中的質量監(jiān)督,生產(chǎn)出安全高效的微生態(tài)制劑產(chǎn)品。

4.4 增加飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖戶對微生物的科學認識，達到合理使用，發(fā)揮效益。

微生物作為飼料添加劑可改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境、提高營養(yǎng)物質消化率，增強機體免疫力、清除體內(nèi)毒素，提高宿主對疾病抵抗力而逐漸在生產(chǎn)中應用。其使用效果與添加微生物的數(shù)量密切相關，數(shù)量不足在體內(nèi)不能形成優(yōu)勢菌群，
難以起到益生作用；
然而雜菌數(shù)量過多，反而會引起仔畜禽腹瀉或消耗營養(yǎng)，甚至影響了動物的生長發(fā)育。此外，還應針對不同的畜禽和不同生長階段，合理選擇使用微生物品種和數(shù)量，以使經(jīng)濟效益最大化。

相信，只要有高質量的微生物種、科學合理的生產(chǎn)工藝、嚴格的質控措施和正確的使用方法，益生素產(chǎn)業(yè)一定會有強勁的生命力，并在促進飼料工業(yè)和畜牧業(yè)綠色化中發(fā)揮重要作用。

我國動物微生態(tài)產(chǎn)業(yè)存在的問題與發(fā)展對策

中國農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)學國家重點實驗室/張日俊

動物微生態(tài)學的發(fā)展，使人們對動物腸道微生物菌群的作用有了更深刻和更廣泛的認識；同時，由于在畜禽養(yǎng)殖業(yè)和飼料中長期地、過量地和不合理地使用或濫用抗生素，出現(xiàn)了一系列問題，如引起動物體內(nèi)菌群失調(diào)或紊亂或條件性致病菌異位轉移、多重耐藥性菌株產(chǎn)生(Alanis, 2005)以及在畜禽產(chǎn)品(如肉、蛋、奶)中的殘留和環(huán)境污染等，特別是抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhoea)、耐藥性艱難梭菌腹瀉(drug-resistance Clostridium difficile-associated diarrhea)和耐藥性過路菌腹瀉(如環(huán)境中的耐藥性大腸桿菌、沙門氏菌等)，正嚴重危害著畜牧業(yè)的健康發(fā)展，導致用藥無效或用藥量增加，惡性循環(huán)。同時，由于廣泛的耐藥細菌引發(fā)的感染也是21世紀嚴重危害人類健康和安全的重大問題之一。為此，國內(nèi)外科學界和產(chǎn)業(yè)界都在積極探索和尋找抗生素替代品，這包括微生態(tài)制劑(Microecological preparation)又稱直接飼喂的微生物(Direct-fed microbials，DFMs)或益生素(Probiotics)或微生物飼料添加劑(microbial Additive)或微生態(tài)調(diào)控劑(Microecological modulator)以及益生元(Prebiotics)、植物提取物(Plant extract)、生物活性肽(Bioactive peptide)或抗菌肽(Antimicrobial peptide)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulator)等，縱觀國內(nèi)外的發(fā)展情況，微生態(tài)制劑將會成為抗生素替代品的主力軍(Trafalska and Grzybowska, 2004; Valentine, 1955)，而且目前市場上微生態(tài)制劑的品種也越來越多，從菌種品質上講，可謂是優(yōu)劣混雜；從劑型上看，有液劑、粉劑、半干半濕粉等；活菌標示值上，也是高高低低，真假難分；菌種安全性上也缺乏認真的評價。因此，為了使消費者對微生態(tài)制劑的品質、優(yōu)劣等有更深刻和全面的了解，為了推動我國建立微生態(tài)制劑的規(guī)范和標準，本文將重點闡述國內(nèi)微生態(tài)產(chǎn)業(yè)在菌種安全性、產(chǎn)品功能性和生產(chǎn)加工技術等方面存在的一些問題、國外同類產(chǎn)品的評價標準和解決我國益生素產(chǎn)品現(xiàn)存問題的對策，以便使微生態(tài)產(chǎn)業(yè)得到良性發(fā)展，為我國的食品安全作出重要貢獻。

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畜禽腸道微生物菌群有著重要的生物學功能，實施有益的調(diào)控，可促進其生長發(fā)育、營養(yǎng)物質的消化吸收和改善健康狀況，從而減少抗生素的用量，提高我國的食品安全。

動物自出生后就立即處于微生物世界的包圍中，機體凡與外界接觸及相通的部位皆有微生物的存在。在非反芻動物的胃腸道(Gastrointestinal tract,GIT)棲息著300～500種的微生物被稱為微生態(tài)系統(tǒng)(Microbial ecosystems)，包括需氧或厭氧的細菌、真菌和酵母等，每克腸內(nèi)容物中的微生物數(shù)量高達1010～1011個，超過機體細胞總數(shù)的10倍，這些胃腸道微生物(Gastrointestinal microbiota)群系之間及微生物與動物之間形成了相互依存、相互作用的不可分割的整體，參與了動物體的生長、發(fā)育、消化、吸收、營養(yǎng)、免疫、生物拮抗及其各種功能和結構的發(fā)生、發(fā)展和衰退的全過程。消化道正常微生物菌群(Normal microflora/microbiota)可根據(jù)其作用分為三類：①共生性細菌：是主要菌群(＞90%)，主要指專性厭氧或兼性厭氧菌如乳酸菌和雙歧桿菌，這類生理性細菌數(shù)量大，恒定存在，對機體有益無害，在維持消化道微生態(tài)平衡上起著重要作用，同時，起著提供或豐富營養(yǎng)、促進消化、刺激免疫和消除腸內(nèi)毒素等作用。共生菌與腸上皮密切接觸，其生理和代謝活動與細胞的生理和代謝活動密切相關，甚至融為一體。這類細菌可以自營同時又可利他(宿主)，細菌將復雜的碳水化合物(纖維素或非淀粉多糖)發(fā)酵成為乳酸或揮發(fā)性脂肪酸(如丙酸)。乳酸在腸道形成酸性環(huán)境，對其它致病菌可產(chǎn)生“競爭排除作用”，但乳酸堆積多也會刺激腸道蠕動，使腸道內(nèi)容物排空加快。②機會性細菌：約占10%，包括無病原性的大腸桿菌、鏈球菌及腸球菌等。這些機會性細菌視腸道環(huán)境而改變停留在腸道的數(shù)量及時間。③致病性細菌：含量極少(＜0.01%)的致病性菌群，包括梭菌、葡萄球菌、偽單胞菌、病原性大腸桿菌、沙門氏菌以及部分真菌。這類菌群不僅具有致病性，同時他們也會消耗宿主的能量，而其發(fā)酵產(chǎn)物(如氨氣、H2S等)也可能對宿主有害，還導致體內(nèi)腐敗物、致癌物及毒素的增加。正是動物腸道中的大量微生物與其所處的微環(huán)境構成了“微生態(tài)三角”，即在宿主遺傳的控制下，正常微生物菌群、免疫與營養(yǎng)構成的相互依賴、相互制約的關系。正常的微生物菌群的生理功能是動物生存必需的一個生理系統(tǒng)，動物是動物真核細胞和細菌原核細胞構成的綜合體，微生態(tài)系統(tǒng)是除骨骼、肌肉、神經(jīng)、附屬(皮、毛、指或趾甲)、淋巴(免疫)、呼吸、消化、內(nèi)分泌、心血管、泌尿、雄性和雌性生殖系統(tǒng)(Morieb,1995)之外的第十三個生理系統(tǒng)。第十三系統(tǒng)發(fā)揮著一系列重要的作用：①胃腸菌群促進胃腸黏膜細胞的發(fā)育和成熟(解剖修飾作用)；②腸粘的菌群屏障作用；③口服耐受性和激活免疫系統(tǒng)，促進免疫細胞成熟，包括B細胞、T細胞、M細胞及吞噬細胞、體液免疫、細胞免疫、產(chǎn)溶菌酶細胞等；④產(chǎn)生多種消化酶，促進營養(yǎng)消化、吸收和代謝，包括對蛋白質或氮素、脂類、碳水化合物、維生素、無機鹽和黏液代謝等；⑤胃腸菌群產(chǎn)生遷移傳動復合物(migrating motor complexes,MMC),刺激腸蠕動；⑥代謝產(chǎn)酸，酸化腸道環(huán)境，活化酶系統(tǒng)和抑制偏堿性有害微生物的生長。動物的微生態(tài)系統(tǒng)就是通過上述多種作用，最終產(chǎn)生抑制有害菌群，增強免疫功能，防治疾病，提高飼料營養(yǎng)素的消化吸收和轉化效率，促進動物產(chǎn)品(肉、蛋、奶、毛、皮等)的形成和品質改善。可見，胃腸道微生物存在復雜的多樣性，因此表現(xiàn)出菌群和功能的多樣性。動物體內(nèi)各種微生物的組成和結構(比例)直接影響其生命活動向或好或壞的方向發(fā)展。因此，對胃腸道微生物進行調(diào)控有著重要的實踐意義。

微生態(tài)制劑又稱益生素(Probiotics)是一種重要的腸道菌群調(diào)節(jié)劑，傳統(tǒng)概念認為，益生素是指攝入動物體內(nèi)參與腸內(nèi)微生態(tài)平衡的具有直接通過增強動物對腸道有害微生物的抑制作用，或者通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，而間接起到促進動物生長作用和提高飼料轉化率的活性微生物培養(yǎng)物。1994年在德國舉行的國際會議上，各國微生態(tài)學家在總結該學科近些年研究成果的基礎上，給益生素賦予了新的內(nèi)涵，一致認為，益生素是含活菌和(或)死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細菌制品，經(jīng)口或經(jīng)由其它粘膜途徑投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機制。這個概念能更加準確、全面地概括益生素的組成和功能。對腸道菌群的調(diào)控有著重要的作用，主要包括：①對營養(yǎng)物質消化吸收利用條件的重建；②免疫力或抗病力的重建；③生長條件的重建。

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飼料安全、人類的食品安全和健康需要微生態(tài)制品

近年來的大量研究表明，人類常見的健康問題如癌癥、畸形、抗藥性和某些中毒現(xiàn)象與肉、蛋、奶中的抗生素、激素和其它合成藥物的殘留有關，從而促使各國紛紛立法限制和禁用抗生素、激素等添加劑在飼料中的使用，如歐盟農(nóng)業(yè)委員會立法從1999年7月1日起禁止在飼料中添加桿菌肽、螺旋霉素、維吉尼亞霉素、泰樂菌素4種抗生素；2003年1月歐盟農(nóng)業(yè)委員會立法到2006年1月全面禁止目前仍然使用的4種飼用促生長抗生素，即黃霉素、莫能霉素、鹽霉素和卑霉素。與此同時，益生素以其綠色安全、無毒副作用、無殘留的優(yōu)點而備受飼料生產(chǎn)企業(yè)和畜牧養(yǎng)殖者的青睞，并得到廣泛應用。益生素作為一種抗生素替代品，在發(fā)展綠色畜牧業(yè)、提高飼料和食品安全、促進人類健康方面有著重要的作用。

但是，目前國內(nèi)微生態(tài)制劑正處于發(fā)展階段，由于各生產(chǎn)廠家生產(chǎn)工藝不一，造成產(chǎn)品質量參差不齊，再加上用戶選擇和使用不當，而出現(xiàn)使用效果不同、褒貶不一的局面，影響了微生物作為抗生素替代飼料添加劑的發(fā)展。這樣不利于我國微生態(tài)制劑(益生素類)產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

3
國內(nèi)益生素制劑現(xiàn)存的主要問題及國外的評價標準

3.1 菌種(菌株)選用不規(guī)范或變異性較大

3.1.1 益生素菌種屬、種、株(Genus/species/strain)

菌種是微生態(tài)制劑生產(chǎn)的關鍵，也是微生態(tài)制劑質量的直接和重要保證。各國對作為益生素的菌種(菌株)都有明確規(guī)定，如1989年美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協(xié)會(AAFCO)公布了43種“可直接飼喂且通常認為是安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)”作為微生態(tài)制劑的出發(fā)菌株，主要有細菌(bacteria)、酵母(yeast)和真菌(fungi)，其中乳酸菌28種(包括乳酸桿菌12種、雙歧桿菌6種、鏈球菌6種、片球菌3種、明串珠菌1種)、芽孢桿菌5種、擬桿菌4種、曲霉2種、酵母菌2種等。其中，①乳酸桿菌屬(Lactobacilleae)12種：短乳桿菌(L. Brevis)、嗜酸乳桿菌(L. Acidophilus)、保加利亞乳桿菌(L. Bulgaricus)、干酪乳桿菌(L.Casei)、纖維二糖乳桿菌(L. Cellosus)、彎曲乳桿菌(L. Curvatus)、德氏乳桿菌(L. Delbruekii)、發(fā)酵乳桿菌(L. Fermentum)、羅特氏乳桿菌(L. Reuterii)、乳酸乳桿菌(L. lactis)、植物乳桿菌(L. Plantarum)。②雙歧桿菌屬(Bifidobactirium)6種：青春雙歧桿菌(B. adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)、動物雙歧桿菌(B. animalis)、長雙歧桿菌(B. longum)、嗜熱雙歧桿菌(B. thermophilum)、兩歧雙歧桿菌(B. bifidum)。③腸球菌屬(Enterococcus)2種：糞腸球菌(E.faecalis)又稱糞鏈球菌(S. faecium)、屎腸球菌(E.faecium)又稱屎鏈球菌(S. faecium)。④鏈球菌屬(Streptococcus)5種：嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)、乳酸鏈球菌(S. lactis) 又稱乳酸乳球菌(L.lactis)、中間型鏈球菌(S. intermedius)、乳脂鏈球菌(S. cremoris)、二丁酮鏈球菌(S. diacetylactis)。⑤芽孢桿菌屬(Bacillus)5種：凝結芽孢桿菌(Bacillu coagulans)、緩慢芽孢桿菌(B. lentus)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniforms)、短小芽孢桿菌(B. pumilus)。⑥明串珠菌屬(Leuconostoc)1種：腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。⑦片球菌屬(Pediococcus)3種：乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(P. cerecisiae)、戊糖片球菌(P. pentosaceus)。⑧乳球菌屬(Lactococcus)1種：乳酸乳球菌(L.lactis)又稱乳酸鏈球菌(S. lactis)。⑨丙酸桿菌屬(Propionibacterium)2種：謝氏丙酸桿菌(P.shermanii)、費氏丙酸桿菌(P. Freudenreichii)。⑩擬(類)桿菌屬(Bacteroides)4種：豬擬(類)桿菌(B. suis)、瘤胃生擬(類)桿菌(B. ruminocola)、多毛擬(類)桿菌(B. Capillosus)、嗜淀粉擬(類)桿菌(B. amylophilus)。酵母菌屬(Yeast)2種：啤酒酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)。曲霉菌屬(Aspergillus)2種：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A. oryzae)。

我國農(nóng)業(yè)部1999年6月公布(105號公告)了可以直接調(diào)喂動物的飼料級微生物添加劑菌種有12個：干酪乳桿菌( Lactobacillus casei)、植物乳桿菌(L．Planetarium)、嗜酸性乳桿菌(L．Acdophilus)、糞鏈球菌(Straptoccus
faecium)、乳鏈球菌(S．Lactis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(B．natto)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒酵母(Sacchace
cerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。

FAO/WHO《關于食用微生物選用評價規(guī)則》(FAO/WHO, 2002)指出，食用微生物的菌株必須通過表型和基因型的鑒定，并通過體外和動物試驗證明有明確的功能和良好的安全性，還要通過1期臨床試驗。

1989年美國FDA把傳統(tǒng)上通稱的益生素定義為可直接飼喂的微生物(Direct-fed microbials, DFMs)，這些微生物菌種應具有以下特性：①產(chǎn)生有機酸，如乳酸、乙酸、甲酸等，這些酸能夠抑制病原微生物，也可作為動物的能量或對其他微生物有益；②產(chǎn)生抗菌物質，如細菌素、過氧化氫或其他化合物抑制病原微生物；③有益微生物粘附占位，競爭排除，防止病原微生物定植；④刺激免疫反應，增加免疫系統(tǒng)活力；⑤產(chǎn)生各種消化酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和糖苷酶(glycosidases)，提高飼料利用效率，此外雙歧桿菌還產(chǎn)生DNA聚合酶可修復機體損傷的細胞；⑥減少毒胺的產(chǎn)生，中和內(nèi)毒素。

3.1.2 益生素菌種的選擇標準

1992年R.Fukker提出作為益生素的菌種應符合以下標準：①微生物必須是大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的活菌制劑；②在保藏和使用期間，應保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)；③必須能在人體腸道中存活；④必須對宿主產(chǎn)生有益作用；⑤應是人體腸道正常菌群的成員(具有調(diào)節(jié)和有益作用的外來菌也可以)。

目前國內(nèi)有些廠家的菌種(菌株)實際并沒有嚴格按照微生物的標準進行篩選。有些同一名稱種屬下的菌株可能存在很大差異，雖然有些菌種“名稱”相同，如都是乳酸菌或酵母菌或芽孢桿菌或雙歧桿菌，但是由于同名菌種的不同菌株的生理特性(如生長快慢、最佳生長溫度、所需生長環(huán)境或條件、世代間隔、代謝產(chǎn)物等)和功效性存在較大差異，最終表現(xiàn)的功效也會有明顯不同。由于這方面的差別，導致含有相同名稱菌株的益生素產(chǎn)品，表現(xiàn)出明顯不同的功效，這如同不同人與人之間的能力、本領、財富等方面有天壤之別一樣。因此，生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種必須經(jīng)過嚴格篩選，這是生產(chǎn)出高質量的微生態(tài)制劑的關鍵。

3.2 菌種的安全性評價缺乏系統(tǒng)的證據(jù)

國內(nèi)有關微生物的安全性試驗研究較少，多數(shù)試驗廠家僅研究了微生態(tài)制劑的產(chǎn)品功效，測定指標為動物日增重、飼料轉化率、腸道微生態(tài)的影響和宿主發(fā)病率和死亡率評價，而對宿主、畜產(chǎn)品和人類食物鏈的安全評價試驗很少。為了人類自身安全、食品安全和環(huán)境污染應更多關注微生物安全性研究。

3.2.1 菌種安全性

作為飼料添加劑的菌種(菌株)應經(jīng)過嚴格的病理與毒理試驗，證明無毒、無致畸、無耐藥性、無藥殘等副作用。一株現(xiàn)在無毒副作用的菌種，將來也可能會因為理化、微生物毒素和菌種本身原因引起負性突變，所以應定期對生產(chǎn)菌種進行安全性檢測或評價(Sipsas et al.,2002; Sorokulova et al., 2006; Zhou et al.,2000)。檢測項目包括：藥物抗性試驗、質粒檢測、急性和亞急性毒性試驗、致癌性試驗、半致死量試驗、毒物酶類產(chǎn)生試驗、代謝產(chǎn)物分析試驗(Saarela et al.,2000; Saavedra et al.,2004)。

3.2.2 潛在致病性研究和感染能力的檢測

有益微生物在體內(nèi)正常微生態(tài)條件下，對其宿主動物具營養(yǎng)作用，但在某些條件下可能產(chǎn)生致病性，如近幾年有關乳酸桿菌引起臨床感染的報道。因此，使用微生態(tài)制劑時應綜合考慮動物健康狀況及其它因素以確保安全。

沒有致病性、感染性應該是微生物安全性必須具備的條件(Saarela et al.,2000)。要證明微生物是否具有感染性很困難，特別是厭氧菌。對弱感染力的細菌，即使給健康動物大量口服也不會引起感染。一般采用抗生素脫污染或口服免疫抑制劑等方法，造成動物的菌群屏障功能和免疫功能喪失，再喂給微生態(tài)制劑，檢查其是否引起感染。另外，采用無菌動物或悉生動物檢查微生物的感染。

3.2.3 菌種攜帶抗生素抗性基因的可能性

在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用抗生素，使攜帶抗生素抗性基因的微生物得以繁殖，而微生物的抗性基因一般存在質粒上，質粒是游離于染色體外的小分子遺傳物質，且有很高的遷移性（飄移），容易在不同微生物間傳遞，抗性基因也隨之轉移，這對人畜危害很大。作為益生素的菌株不得攜帶抗生素抗性基因(Saarela et al.,2000)。因而，研制和開發(fā)安全性高的、無耐藥性的微生物制劑，是涉及人類安全與生態(tài)環(huán)境的重大問題。

3.2.4 環(huán)境破壞的可能性

某些菌種的大量應用，通過動物排泄到周圍環(huán)境中，形成優(yōu)勢菌種，可能對改變周邊微生態(tài)系統(tǒng)，對其是否造成危害應長期監(jiān)測觀察。

目前國內(nèi)的問題是，不少廠家的微生態(tài)制劑缺乏潛在致病性和感染力檢測，同時，國家也沒有制訂相應的檢測標準和方法。就上述4個方面而言，國內(nèi)僅規(guī)定要做急性、亞急性毒性試驗，其他安全指標(即3.2.2～3.2.4)均沒有指定要測試。

3.3 對菌種的功效評價指標單一，簡單粗糙，缺乏系統(tǒng)性

目前國內(nèi)有關微生物功效的報道僅局限在產(chǎn)品試驗效果的觀察上，更應對微生物的作用機理應作系統(tǒng)研究。

3.3.1 功效性

評價微生物的功能至少應包括：益生菌對免疫調(diào)控作用、對腸道菌群的調(diào)控、對腹瀉的防治能力、對宿主生理功能(如生產(chǎn)性能)及飼料利用率的影響(Saarela et al., 2000)。

3.3.2 抗逆性

研究不同微生物在體內(nèi)外抵抗胃酸能力、抵抗膽汁酸鹽和耐受一定加工溫度(70～90℃)的能力。微生物耐酸力與抗膽鹽能力進行體內(nèi)試驗難度太大，現(xiàn)多用體外試驗作為評估菌株的耐酸性的相對參考標準(Tuomola et al.,2001)。

3.3.3 定植粘附能力

微生物在腸壁上的黏附是微生物定植過程中的一個重要步驟，是大量繁殖變成優(yōu)勢種群的前提，粘附能力與抗腹瀉、免疫力、競爭排斥及其他有益作用密切相關, 目前用體外試驗來研究和測定(Nemcova,1997; Saarela et al.,2000)。而菌株的黏附力在不同的環(huán)境會發(fā)生變化，同一菌株體外模型不同黏附情況不同，即使同一菌種的不同菌株對同一模型的黏附能力也是不同的(Lehto和Salminen,1996)。

3.3.4 穩(wěn)定性

益生菌在飼料產(chǎn)品中活菌的生物學特性、遺傳學特性應該穩(wěn)定，在使用和貯存期間，應保持穩(wěn)定的活存狀態(tài)。

在上述4個方面，國內(nèi)的問題表現(xiàn)比較突出。一些企業(yè)僅重視功效性試驗，而沒有進行穩(wěn)定性試驗、定植粘附能力和抗逆性試驗。這給一些研發(fā)能力弱、生產(chǎn)水平低下的企業(yè)帶來了可趁之機，以致于生產(chǎn)出來的產(chǎn)品表現(xiàn)出穩(wěn)定性差、批與批之間功效差別較大的問題，也影響了消費者對這類產(chǎn)品的信任度。

3.4 菌株的來源和保存條件不合理

微生態(tài)制劑不同于其它飼料添加劑，它是繁殖和變異很快的活的生物體，對其來源、保存與利用都應有嚴格的規(guī)范和操作程序。　

①菌種來源：菌種來源歷史應清楚，以專門機構審查認可并同意，方可用于生產(chǎn)。保存和分發(fā)也應由專門機構負責或由研制單位專門管理部門保存和分發(fā)。

②菌種保存與利用：生產(chǎn)用菌種應先制成凍干粉，即在菌種管中冷凍干燥一大批，并保存于2℃～3℃以備生產(chǎn)使用。

③凍干菌種檢定合格后才可投產(chǎn)，生產(chǎn)程序為：凍干粉→液體活化→搖瓶→一級種子瓶或二級種子→生產(chǎn)罐發(fā)酵。

④菌種傳代不應超過5代，因過多過傳代易造成細菌某些生物特性變異。

⑤生產(chǎn)用菌種要求長期延續(xù)保持原有特性，菌種必須專人管理，經(jīng)常定期檢查，并應建立菌種檔案資料，包括來源、歷史、篩選、檢定、凍干保存、數(shù)量、啟開使用等完整的記錄，這些都須專門管理部門專門人員承擔。

3.5 生產(chǎn)加工技術不夠合理和科學

目前國內(nèi)有些微生物生產(chǎn)廠家設備簡單，問題較多，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

①生產(chǎn)用的菌種來源不規(guī)范。一些廠家所用的菌種不是祖代經(jīng)冷凍干燥保藏的菌種，而是原種經(jīng)多次傳代的菌種，是否已經(jīng)產(chǎn)生變異并不清楚；或通過搖瓶后直接接種到并沒有滅菌的固體培養(yǎng)介質上放大生產(chǎn)，或任意比例放大生產(chǎn)，導致產(chǎn)品中雜菌嚴重超標，甚至雜菌占據(jù)了優(yōu)勢，以致于使用此類產(chǎn)品后沒有明顯的功效。

②多菌種任意混合，生產(chǎn)微生物添加劑。如目前國內(nèi)生產(chǎn)的益生素制品含有5科10屬80多種微生物，其菌種也未經(jīng)過鑒定和安全性評價，使用此類產(chǎn)品存在潛在的風險。建議益生素生產(chǎn)企業(yè)在復合菌制劑時，要進行科學合理的設計，使用什么樣的菌種、用幾個、如何進行工藝控制等都要周密考慮。

③生產(chǎn)工藝簡單，質量控制不嚴。目前的生產(chǎn)工藝流程主要有固體發(fā)酵、液-固發(fā)酵(即先進行液體發(fā)酵，然后接種到固體培養(yǎng)基上放大發(fā)酵)和液體發(fā)酵幾種生產(chǎn)工藝。

固體表面發(fā)酵法：是把固體表面培養(yǎng)物與載體按比例混合經(jīng)干燥制成，此法生產(chǎn)的產(chǎn)品目標微生物的含量低，易受雜菌污染，質量難以控制，不適于工業(yè)化生產(chǎn)，但投資少。這是目前大部分微生物生產(chǎn)廠家所采用的方法，也是目前影響微生態(tài)制劑推廣應用的主要不利因素。

應采取的正確工藝路線是液體深層高密度發(fā)酵，即：祖代菌種凍干粉→活化→純化→接種搖甁→一級種子或二級種子(在發(fā)酵罐中進行)→生產(chǎn)罐發(fā)酵→發(fā)酵液→后加工(或噴霧干燥、或濃縮后冷凍干燥、或載體吸附干燥、或微膠囊包被)→篩分→質檢→微生態(tài)產(chǎn)品。此法適于工業(yè)化生產(chǎn)，便于無菌操作，但成本高，生產(chǎn)過程能夠嚴格控制，目標菌(有效菌)含量高，雜菌少，菌種純度高，功效明確，也是技術和資金力量較強的企業(yè)采取的生產(chǎn)工藝。例如，由中國農(nóng)業(yè)大學承擔完成的國家“863”高技術計劃和農(nóng)業(yè)“跨越計劃”——“安全高效微生物飼料添加劑‘益生康’中試放大產(chǎn)業(yè)化和應用技術”就是應用這種技術方案。一些發(fā)達國家和地區(qū)如美、日、歐等生產(chǎn)的高品質微生態(tài)制劑也是如此。

生產(chǎn)工藝條件對質量很大影響, 如發(fā)酵溫度和時間會影響產(chǎn)品的質量，干燥工藝和溫度和時間會影響微生物的存活率和活性。例如，使用嗜酸乳酸桿菌，在37℃培養(yǎng)12h與32℃培養(yǎng)48h的同一出發(fā)菌株，其終端代謝產(chǎn)物和作用效果有很大不同。

④干燥方式不科學。干燥過程最易引起菌種存活率降低，目前常用的干燥方式為噴霧干燥和冷凍干燥。

噴霧干燥導致菌種的存活率偏低，大多數(shù)嗜溫菌的存活率僅為10%，某些乳酸菌的存活率為44%。冷凍干燥由于是在低溫下進行，可提高存活率，絕大多數(shù)菌種均可通過冷凍干燥而保存。

⑤產(chǎn)品包裝和劑型不規(guī)范　

由于大多數(shù)微生態(tài)制劑對空氣中的氧敏感,因而應選用密封防潮性能好的包裝材料。塑料薄膜因其透氣性、透濕性、化學穩(wěn)定性和耐熱性較差,不宜作為微生物的包裝材料,而應選用密封防潮性能好的鋁箔或高質量密封好的無毒塑料甁的作為包裝材料。

劑型以微膠囊和雙層膠囊為理想，其它如粉狀和粒狀都不耐加工和貯存。

隨著微囊工藝、緩釋技術和基因工程等新技術的發(fā)展, 這些新技術也將在微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)中得到廣泛應用。

3.6 微生態(tài)產(chǎn)品標示不明確或標示值(label claims)與實際含量(actual contents)不符

微生態(tài)產(chǎn)品應明確標示產(chǎn)品相關信息，包括：

菌種名稱：標準的中文菌種名稱、拉丁文菌種名稱以及菌種來源。

有效菌數(shù)和活力：產(chǎn)品應標示在產(chǎn)品保質期內(nèi)的有效菌數(shù)即產(chǎn)品標示值(label claims)或保證值，即微生態(tài)制劑中能添加飼料中有效活菌數(shù)(指每克成品當中所含有的有效活菌數(shù)量)。國內(nèi)一些益生素產(chǎn)品的實際活菌數(shù)遠遠低于其標示值，問題比較突出。在國外，南非的Elliot and Teversham(2004)評價了9個從美國和歐洲進口的益生素產(chǎn)品，結果發(fā)現(xiàn)僅有5/9產(chǎn)品的標示值與實測值相符，3/9的產(chǎn)品標示的菌種與實際相符。

此外，還包括產(chǎn)品功效、配伍禁忌、使用方法、產(chǎn)品保質期、生產(chǎn)日期等。

4
對國內(nèi)微生態(tài)行業(yè)的幾點建議

如前所述，隨著抗生素的負面影響暴露的越來越多，微生態(tài)制劑必將在替代抗生素、提高飼料和食品安全等方面發(fā)揮重要作用。但是，微生態(tài)產(chǎn)業(yè)目前存在一系列問題，為了促進微生態(tài)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和發(fā)揮其優(yōu)勢作用，提出如下建議，以供本行業(yè)和政府部門參考。

4.1 盡快建立有關產(chǎn)品標準

國家有關部門盡快建立飼用微生物和微生物飼料添加劑質量監(jiān)督檢驗測試中心，組織專家建立有關微生態(tài)產(chǎn)品標準、生產(chǎn)工藝標準，這是國家對微生態(tài)制劑實行監(jiān)督的準繩，也是國家對微生態(tài)制劑生產(chǎn)和質量的最低要求。微生物標準化是組織微生物生產(chǎn)和提高制品質量的重要手段,在飼料添加劑行業(yè)標準尚未建立之前，可參照FAO/WHO制訂的評價標準《Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food》或國內(nèi)醫(yī)藥行業(yè)《生物制品試行規(guī)程》，它是我國生物制品的國家標準和技術法規(guī)，包括生產(chǎn)和檢定的技術指標。它來源于生產(chǎn)，反過來又指導生產(chǎn)，不但規(guī)定了生產(chǎn)和檢定技術指標，還對原材料、工藝流程、檢定方法等作了詳細的規(guī)定，對制品質量起到保證作用。

4.2 政府部門加強市場監(jiān)督

政府有關部門通過加強對飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)的管理，對生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)條件應嚴格按獸藥生產(chǎn)規(guī)定和符合GMP標準。

嚴格把好微生物產(chǎn)品批準文號的審批關，要求生產(chǎn)企業(yè)提供產(chǎn)品的詳細資料，如菌種的來源和篩選、菌株的誘變、菌株配伍以及產(chǎn)品的毒理學和流行病學研究的資料。對企業(yè)的產(chǎn)品生產(chǎn)和研發(fā)過程中進行安全監(jiān)控，并嚴厲打擊假昌偽劣產(chǎn)品產(chǎn)品流入市場。

4.3 微生態(tài)制劑生產(chǎn)企業(yè)盡快生產(chǎn)出標示規(guī)范、安全高效的名優(yōu)產(chǎn)品，占領和引導市場。

企業(yè)應根據(jù)微生態(tài)制劑的法定標準和自身的生產(chǎn)工藝制定高于法定標準的內(nèi)控標準。嚴格按照制定的標準對原輔料、包裝材料、中間體、半成品和成品進行檢驗。加強生產(chǎn)過程中的質量監(jiān)督,生產(chǎn)出安全高效的微生態(tài)制劑產(chǎn)品。

4.4 增加飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖戶對微生物的科學認識，達到合理使用，發(fā)揮效益。

微生物作為飼料添加劑可改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境、提高營養(yǎng)物質消化率，增強機體免疫力、清除體內(nèi)毒素，提高宿主對疾病抵抗力而逐漸在生產(chǎn)中應用。其使用效果與添加微生物的數(shù)量密切相關，數(shù)量不足在體內(nèi)不能形成優(yōu)勢菌群，難以起到益生作用；然而雜菌數(shù)量過多，反而會引起仔畜禽腹瀉或消耗營養(yǎng)，甚至影響了動物的生長發(fā)育。此外，還應針對不同的畜禽和不同生長階段，合理選擇使用微生物品種和數(shù)量，以使經(jīng)濟效益最大化。

相信，只要有高質量的微生物種、科學合理的生產(chǎn)工藝、嚴格的質控措施和正確的使用方法，益生素產(chǎn)業(yè)一定會有強勁的生命力，并在促進飼料工業(yè)和畜牧業(yè)綠色化中發(fā)揮重要作用。