發(fā)酵豆粕工藝與固體發(fā)酵過程監(jiān)測指標(biāo)初探

葉赫娜蘭.孤城

摘要：按照工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的基本觀點，離開過程控制，發(fā)酵工藝就不可能進行，也就談不上可重復(fù)性和穩(wěn)定性。成熟的發(fā)酵技術(shù)特點就是嚴(yán)格的過程控制。而過程控制的實現(xiàn)，需要對過程參數(shù)進行選取和有效監(jiān)測。這些被選定和監(jiān)測的參數(shù)，表現(xiàn)的是微生物群體代謝所體現(xiàn)出的宏觀變化。一般性地被稱作發(fā)酵生理參數(shù)，以有別于生化參數(shù)等細胞水平和亞細胞水平的代謝指標(biāo)。
沒有參數(shù)的發(fā)酵過程是不可能實現(xiàn)穩(wěn)定的。必須克服或部分克服以上困難，提供可靠的生理參數(shù)數(shù)據(jù)，實現(xiàn)發(fā)酵豆粕工藝的穩(wěn)定性。
目前在發(fā)酵豆粕一般應(yīng)用中，文獻可以查到的固體發(fā)酵工藝，無一具有過程控制，而實現(xiàn)過程控制是真正工業(yè)化的前提。要想實現(xiàn)控制，必須進行發(fā)酵生理數(shù)據(jù)的采集與分析。目前參照液體深層發(fā)酵工藝所選用的檢測方法是有效地。
由于參數(shù)選取過程中就考慮到工業(yè)應(yīng)用，這些參數(shù)具有快速檢測的可能。

關(guān)鍵詞：豆粕發(fā)酵；檢測；監(jiān)測指標(biāo)；過程控制

葉赫娜蘭.孤城

1.豆粕發(fā)酵的意義與效果

豆粕是廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)的蛋白源。但是，豆粕本身的某些理化特點，限制了豆粕應(yīng)用價值的體現(xiàn)。如，抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，氨基酸的不平衡，結(jié)構(gòu)致密造成的適口性差和消化率偏低等。目前，應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)處理豆粕，是有效提高豆粕品質(zhì)的方法之一。

比如，在抗?fàn)I養(yǎng)因子方面，通過發(fā)酵技術(shù)，可將目前已知的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子去除。見表1。

項目        優(yōu)質(zhì)豆粕        發(fā)酵豆粕
胰蛋白酶抑制因子mg/g        10-15        ≤1
植酸mg/g        10.60        --
大豆凝血素mg/g        1.93-7.58        --
不亮寡糖%        5-20        ＜0.9
致甲狀腺腫素1/106        165.59        --
大豆球蛋白mg/g        400        ＜0.02
β-大豆伴球蛋白mg/g        155        ＜0.01
脲酶活性        0.4        0.02
脂肪氧化酶相對活性        98        --

表-1    豆粕發(fā)酵前后各指標(biāo)比較

在發(fā)酵過程中還可以產(chǎn)生直接被動物吸收的小肽和其他多種生物活性物質(zhì)，這對動物的生長十分有利。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的呈味物質(zhì)，對于動物，特別是幼齡動物，具有明顯的誘食效果。并且，由于部分碳水化合物被降解，豆粕致密的結(jié)構(gòu)變得疏松，適口性顯著提高。

葉赫娜蘭.孤城

2.發(fā)酵豆粕常見菌種與工藝特點

目前，應(yīng)用于豆粕發(fā)酵的菌株很多。在菌株選擇方面，只要不產(chǎn)生毒素，并且在食品發(fā)酵或獸用微生態(tài)制劑中應(yīng)用的菌株，在豆粕發(fā)酵中都可能用到。細菌中，乳酸桿菌和芽孢桿菌得到應(yīng)用。酵母菌中，釀酒酵母和擬內(nèi)孢酶得到應(yīng)用。真菌中，曲霉，根霉，木霉，毛霉都得到應(yīng)用。雖然目前沒有擔(dān)子菌等大型真菌用于發(fā)酵豆粕的報道，但理論上，由于擔(dān)子菌產(chǎn)生高活性的纖維素酶，相對細菌，擔(dān)子菌處理豆粕應(yīng)該具有一定優(yōu)勢。當(dāng)然，沒有放線菌用于發(fā)酵豆粕的報道。

雖然豆粕發(fā)酵中菌株應(yīng)用較多，但發(fā)酵工藝卻具有趨同的傾向。目前常見的工業(yè)水平的發(fā)酵豆粕，選用工藝一般具有以下幾個特點：

1，        應(yīng)用固體發(fā)酵工藝，而不是液體發(fā)酵工藝。
2，        開放式接種，優(yōu)勢培養(yǎng)或多菌株培養(yǎng)，而不是純培養(yǎng)。
3，        豆粕發(fā)酵前的預(yù)處理階段一般省略掉消毒過程。

這是由于發(fā)酵豆粕大量應(yīng)用在畜牧行業(yè)，所以，低附加值的現(xiàn)實，壓縮豆粕發(fā)酵工藝成本所致。固體發(fā)酵工藝相對液體發(fā)酵工藝，雖然因為水活度的問題，有效率偏低的缺點，但卻節(jié)省了烘干或噴干成本，在動力上比較合算。而固體發(fā)酵工藝純培養(yǎng)的實現(xiàn)，要比液體發(fā)酵工藝?yán)щy，也就意味著提高成本，因此在豆粕發(fā)酵中選用了優(yōu)勢培養(yǎng)或混菌培養(yǎng)。由于已經(jīng)不是純培養(yǎng)工藝，這就為省掉消毒過程，進一步降低動力成本提高了條件。因此，在成本的壓力下，雖然選用菌株有異，但發(fā)酵豆粕工藝具有趨同的特點。

整體看來，發(fā)酵豆粕技術(shù)（含菌種和工藝），是在食品發(fā)酵發(fā)展或參考食品發(fā)酵而來的。由于時間積累的限制，雖然工藝已經(jīng)有趨于相同的表現(xiàn)，但整體技術(shù)水平還處于比較低的狀態(tài)。或說，相對于以抗生素為代表的液體深層發(fā)酵，尚處于有待發(fā)展的初級階段。

成熟工藝或成熟技術(shù)的最明顯的特點是工藝的穩(wěn)定性以及對這種穩(wěn)定性實現(xiàn)手段的規(guī)范性。穩(wěn)定性的外在表現(xiàn)，是可重復(fù)性。除了經(jīng)濟性，可重復(fù)性是衡量某工藝工業(yè)化價值的唯一指標(biāo)。應(yīng)用目前常見的發(fā)酵豆粕工藝，批次差異巨大，可重復(fù)性低是不爭的事實。

葉赫娜蘭.孤城

3.限制發(fā)酵豆粕工藝成熟的原因是發(fā)酵過程控制的缺失
   
按照工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的基本觀點，離開過程控制，發(fā)酵工藝就不可能進行，也就談不上可重復(fù)性和穩(wěn)定性。成熟的發(fā)酵技術(shù)特點就是嚴(yán)格的過程控制。而過程控制的實現(xiàn)，需要對過程參數(shù)進行選取和有效監(jiān)測。這些被選定和監(jiān)測的參數(shù)，表現(xiàn)的是微生物群體代謝所體現(xiàn)出的宏觀變化。一般性地被稱作發(fā)酵生理參數(shù)，以有別于生化參數(shù)等細胞水平和亞細胞水平的代謝指標(biāo)。

對于生理參數(shù)的選取和大量測定，是實現(xiàn)過程控制的前提。一般常見的生理參數(shù)為：pH值，生物量（用菌濃，濕菌體含量，干菌體含量，涂布菌落，細胞量，OD值等來表示。），糖含量，氨基氮含量，可溶性磷含量，目標(biāo)產(chǎn)物含量，溶氧，尾氣中氧，二氧化碳含量，發(fā)酵過程熱量的產(chǎn)生速率（一般通過降溫水流量標(biāo)示），等等。其中，最常用的為pH值，生物量，糖，氮，磷含量和目標(biāo)產(chǎn)物含量。真正的數(shù)據(jù)分析，以實現(xiàn)過程控制，就是以來對這幾個參數(shù)的分析與綜合進行的。

但是，雖然各種檢測手段，如，HPLC,GC，電泳，分管光度法，甚至酶聯(lián)免疫吸附法等監(jiān)測技術(shù)頻繁應(yīng)用于豆粕發(fā)酵，但豆粕發(fā)酵的過程控制還是接近于沒有。原因是這一系列的檢測方法，只不過是在發(fā)酵結(jié)束后的成品監(jiān)測中被應(yīng)用，以證明發(fā)酵的效果和必要性的。而并不方便應(yīng)用在過程監(jiān)測中。

發(fā)酵豆粕，甚至整個固體發(fā)酵工藝，相對于液體深層發(fā)酵，在發(fā)酵過程控制方面，主要存在以下三個差異：

1，        沒有成熟選定的，行業(yè)內(nèi)技術(shù)人員統(tǒng)一認(rèn)可的生理參數(shù)，甚至根本沒有任何形式的生理參數(shù)及檢測和監(jiān)測方法。
2，        因為沒有生理參數(shù)，也就沒有對生理參數(shù)曲線分析水平的過程控制，也就不能真正實現(xiàn)工藝過程的可重復(fù)性。
3，        行業(yè)中缺乏對生理參數(shù)分析，以實現(xiàn)工藝過程穩(wěn)定的習(xí)慣和意識。

造成這些差異的原因可以在兩個方面進行分析。首先，發(fā)酵豆粕工藝基本脫胎自食品發(fā)酵的固體發(fā)酵工藝，而食品固體發(fā)酵技術(shù)，過程控制和經(jīng)典發(fā)酵不同，是基于經(jīng)驗而不是基于生理參數(shù)的。但食品發(fā)酵工藝經(jīng)歷了數(shù)百年經(jīng)驗積累，由于成本壓力，發(fā)酵豆粕技術(shù)只繼承了食品工藝的大致過程，而沒法真正延續(xù)食品發(fā)酵的控制模式，這就使得豆粕發(fā)酵技術(shù)具有某種程度的先天不足。其次，固體發(fā)酵工藝相對液體發(fā)酵工藝，所面對的物料理化性質(zhì)不同。在液體發(fā)酵中，所有生理參數(shù)是在水溶液里測定的，但在固體發(fā)酵中，所面對的物料是固體的。這就為生理參數(shù)的選取和測定方法的建立提供了阻力。另一方面，由于在液體發(fā)酵中的劇烈攪拌，已經(jīng)使得任何一點取樣都具有整體意義，而對于固體物料，每一點僅僅代表了當(dāng)前點的狀況。這就使得單點監(jiān)測值沒有代表意義。

沒有參數(shù)的發(fā)酵過程是不可能實現(xiàn)穩(wěn)定的。必須克服或部分克服以上困難，提供可靠的生理參數(shù)數(shù)據(jù)，實現(xiàn)發(fā)酵豆粕工藝的穩(wěn)定性。

葉赫娜蘭.孤城

4.發(fā)酵豆粕工藝生理數(shù)據(jù)檢測方法與分析方法的建立

一般發(fā)酵工業(yè)生理參數(shù)的選取和監(jiān)測方法的建立，遵循以下三個原則：

1，        取樣方法簡單，易于獲取或經(jīng)過簡單處理后，易于獲取具有可以代表整體的普遍性意義的樣本。
2，        檢測方法簡單，最起碼簡單到已經(jīng)在行業(yè)內(nèi)通用或可以在行業(yè)內(nèi)通用。
這樣就為在行業(yè)內(nèi)工程人員的交流提供可能，也為進一步改進檢測方法提供可能。
3，        相對于準(zhǔn)度，更要求具有低散布性，高精度的檢測方法。
在參數(shù)選取后，需要真實值以作出最后的結(jié)論或幫助作出最后的結(jié)論的情況下，準(zhǔn)度是一個比較重要的選取檢測方法的依據(jù)。但在過程控制中，由于看中的是曲線的發(fā)展趨勢，并且經(jīng)常要對曲線進行數(shù)學(xué)運算等處理。如積分，微分等等，以發(fā)現(xiàn)參數(shù)細微變化對宏觀代謝的意義，這就使得精度的意義十分重大。

在固體發(fā)酵工藝參數(shù)選擇，也應(yīng)該遵循以上三個原則。雖然固體發(fā)酵是面對固體物料，但是，由于一切生命代謝都是在水溶液中進行，固體物料實質(zhì)上是一個氣，液，故三相的復(fù)雜生物體系。這種體系的成分復(fù)雜，待測指標(biāo)含量隨時間差異變化極大，隨著發(fā)酵批次的變化和同批次發(fā)酵時間的變化，適應(yīng)性差的檢測方法，會得出不準(zhǔn)確的結(jié)果或引起嚴(yán)重的假象。所以我們參照液體深層發(fā)酵的檢測，盡可能建立穩(wěn)定性強，抗干擾，適應(yīng)度廣的方法。在這個前提下，提出五個生理參數(shù)，對固體發(fā)酵進行調(diào)控。

1，        失重比
在衡量液體發(fā)酵過程中的宏觀變化時，生物量的變化是一個重要指標(biāo)。這是因為發(fā)酵液可以看作是“菌懸液”，而視為一種不易沉淀的懸濁液。通過離心，可以把細胞和液體分開，而得到所謂“濕菌濃”或再烘干，得到“干菌濃”。并且由于菌體和溶液的物理性質(zhì)差異，在全水溶培養(yǎng)基中，可以通過分光光度法測得細胞量的變化?；蛘?，應(yīng)用發(fā)酵液攪拌充分，粘度大，細胞不易沉降的特點來吸取部分發(fā)酵液進行平板涂布，通過數(shù)菌落的方法算出單位溶液內(nèi)的活菌數(shù)。
但是，固體發(fā)酵工藝受本身物料性質(zhì)和細胞代謝的限制，就不能套用類似的方法來簡單的衡量宏觀代謝。這是因為固體發(fā)酵的含水量極低，大概在50%左右。這種情況下，不僅微生物細胞不能自由移動，就是水溶性營養(yǎng)物質(zhì)也是相對固定的。由于培養(yǎng)及配方組成中各組分物理性狀的差異，特別是透氣能力帶來的極短位移上代謝強度的急劇變化，即便是單細胞微生物培養(yǎng)工藝，也使得取樣粉碎進行平板涂布測量平均單位體積內(nèi)活細胞量變得不可能。更不用說離心菌濃和分光光度法測得OD值的可能性了。
但是，按照發(fā)酵動力學(xué)原理，發(fā)酵過程的能耗速率，是和活細胞量呈正比關(guān)系的，也就是說，可以通過對能耗的描述，來控制宏觀代謝的強度。而能耗可以看做主要是以二氧化碳和氨氣損耗掉的重量。
在固體發(fā)酵中，如果把所有單個活細胞的能耗速度看做相同，則對干重的損失量的微分，是和生物量成正比的。在習(xí)慣了這種描述后，即便不做微分，也可以通過對干物質(zhì)重量損耗的描述，實現(xiàn)對細胞宏觀代謝的把握。
這就可以提出“失重比”的概念，即，經(jīng)過若干小時發(fā)酵后，干物質(zhì)相對起始時間的損耗率。

2，        pH值
僅僅一個參數(shù)是不能描述生理代謝的，在引入新的參數(shù)時，首先注意到最方便測得的參數(shù)之一是pH值。
同樣由于含水量的問題，使得常規(guī)的工業(yè)用pH測定儀不能直接用在固體發(fā)酵工藝中，而用微觀pH儀實現(xiàn)工業(yè)測定又不現(xiàn)實，這就只能使用一種約定的方法，測定相對的pH變化。
暫時規(guī)定，每20克烘干固體發(fā)酵物料混合于200毫升中性水的過濾液的pH為指定pH值，進行個發(fā)酵批次間或同批次不同樣本間比較。
3，        還原糖或總糖
依據(jù)固體發(fā)酵工藝和培養(yǎng)基配方的不同，可以進行還原糖或總糖的檢測。樣本處理方法參考pH值的檢測，應(yīng)用液體深層發(fā)酵還原糖，總糖檢測方法，得出單位干重所含還原糖或總糖含量。單位為質(zhì)量百分比。

4，        氨基氮
同樣依據(jù)固體發(fā)酵工藝和培養(yǎng)基配方的不同，參考液體深層發(fā)酵氨基氮檢測方法，進行氨基氮含量的檢測。單位為毫克/千克。

5，        溶磷
同樣依據(jù)固體發(fā)酵工藝和培養(yǎng)基配方的不同，參考液體深層發(fā)酵溶磷檢測方法，進行固體發(fā)酵可溶性磷含量的檢測。單位為毫克/千克。

對于取樣方式，同樣由于物料的含水量過低，而帶來的單一樣本不能代表全部物料的性質(zhì)，而對取樣方式提出了不同于一般液體發(fā)酵工藝監(jiān)測取樣的要求。

首先，由于物料不能流動，則取樣必須多取。其次，取樣不能參照原料監(jiān)測和成品檢測的方法選點，即不能分散選點和隨機選點，而應(yīng)該在最具有代表性或最正常的部位選點。

目前的方法是，在最具有代表性的區(qū)域，隨機選取五個點，進行取樣，檢測后，把最接近的三個值求算術(shù)平均，而把其余兩個值舍掉。

葉赫娜蘭.孤城

5.固體發(fā)酵過程監(jiān)測實例與應(yīng)用效果

對生理數(shù)據(jù)的分析作用發(fā)揮最大的地方是發(fā)酵過程工程，也就是工藝路線的選擇和工藝參數(shù)的制定及其實現(xiàn)，其次是在成熟工藝的日常發(fā)酵過程中。下面的例子，通過對發(fā)酵過程中生理參數(shù)的測定和分析制定了工藝，可以看做是過程檢測的初步實際應(yīng)用。

實驗地點：山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物技術(shù)國家重點實驗室，國家糖工程技術(shù)研究中心，資源糖室。
所用設(shè)備：搖床，50升自控發(fā)酵罐，固體發(fā)酵床，烘干箱，定量取樣器（自制），常規(guī)檢測設(shè)備。
所選菌株：米曲霉AS3951，為資源糖室保藏。
工藝條件：固體發(fā)酵，物料浸泡但不消毒?？刂茰囟葹榘l(fā)酵室空氣溫度30℃，料溫35℃。起始pH6.5?？刂茲穸冉咏柡?。
工藝配方：干物料85%豆粕，其余略，含水量略。
取樣周期：每三小時一次。
發(fā)酵數(shù)據(jù)：見表2。

周期        0        3        6        9        12        15        18        21        24
失重比        0%        0.5%        3.0%        7.0%        8.0%        14.0%        16.0%        17.0%        17.0%
pH        6.55        6.48        6.45        6.41        6.54        6.87        6.90        6.95        6.85
還原糖        3.2        3.4        3.8        3.0        1.8        1.4        1.4        1.4        1.4
氨基氮        320        320        320        280        400        480        520        360        360
   
表 2   豆粕發(fā)酵過程參數(shù)

如表2所示，在15小時后，物料的pH已經(jīng)下降到最低點，并且反彈。而氨基氮則在15小時后達到最高，以后逐漸下降。同時，在15小時達到能耗速率最高，表現(xiàn)為相對失重比（失重比的斜率）最高。也就是具有較高代謝活性的生物量達到最高。以后，相對失重比降低并趨于平緩，說明進入穩(wěn)定期和衰退期。

以上情況可以這樣理解，在六小時之前的能量損耗，可以理解為延遲期后期和對數(shù)期前期在細胞指數(shù)生長之前的積累。而后進入對數(shù)生長期中期。在這個階段，如同液體發(fā)酵一樣，主要是一個利用碳鏈而不是氮源的過程。并且由于還原糖的利用產(chǎn)生有機酸，似的pH下降。在15小時左右，達到生物量高峰，由于胞外酶的作用，而使得氨基氮達到最高。后來，由于在所謂穩(wěn)定期實際上細胞活性的降低，而氨基氮，相對失重比都下降了。

對于還原糖的測定，也印證了以上數(shù)據(jù)。至于后期還原糖檢測值趨于穩(wěn)定，原因也和液體發(fā)酵一樣，在一定濃度一下的還原糖不再為細胞所識別，而達到最低值。在這以后，除了能夠進一步利用胞外酶降解蛋白外，考慮到氨基氮以氨氣的形式揮發(fā)掉，繼續(xù)發(fā)酵就是對物料的單方面無意義的消耗了。

在以上實驗中，由于配方中較多的應(yīng)用磷酸鹽為緩沖劑，所以磷的基礎(chǔ)較高，溶磷損耗在生物轉(zhuǎn)化中不具備可觀性，故省略監(jiān)測。

考慮到應(yīng)用的是固體不消毒發(fā)酵工藝，目標(biāo)為盡可能多的菌體量和合理處理豆粕但不造成浪費，并且盡可能短的發(fā)酵周期以盡可能減少雜菌污染的機會，提高工藝穩(wěn)定性，故，最后確定，當(dāng)應(yīng)用嚴(yán)格的工藝，使用米曲霉AS3951進行單菌株固體發(fā)酵豆粕時，發(fā)酵時間為15-20小時。其他參數(shù)如pH值，溫度，含水量等暫依文獻或以往經(jīng)驗，不作調(diào)整。

葉赫娜蘭.孤城

6.結(jié)論
   
目前在發(fā)酵豆粕一般應(yīng)用中，文獻可以查到的固體發(fā)酵工藝，無一具有過程控制，而實現(xiàn)過程控制是真正工業(yè)化的前提。要想實現(xiàn)控制，必須進行發(fā)酵生理數(shù)據(jù)的采集與分析。目前參照液體深層發(fā)酵工藝所選用的檢測方法是有效地。

由于參數(shù)選取過程中就考慮到工業(yè)應(yīng)用，這些參數(shù)具有快速檢測的可能。

不僅僅是霉菌，在任何有可能進行工業(yè)化發(fā)酵的場合，如其他真菌（如擔(dān)子菌），酵母菌，細菌，甚至放線菌，或者，不僅僅是發(fā)酵豆粕，包括其他方面，這些參數(shù)和對過程的控制方式，都是可取的，值得繼續(xù)發(fā)展的。

參考文獻：

《微生物技術(shù)開發(fā)原理》，曲音波，化學(xué)工業(yè)出版社
《生物體系中的化學(xué)測量》，上官棣華，趙睿等譯，化學(xué)工業(yè)出版社
《微生物學(xué)》，郭秀君，山東大學(xué)出版社
《發(fā)酵豆粕研究進展》，李建，《糧食于飼料工業(yè)》，2009，NO.6

穆然

呵呵呵呵.....孤城的專業(yè),很不錯的資料

牧場俠客

再多發(fā)點

葉赫娜蘭.孤城

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