板藍(lán)根多糖對(duì)雞新城疫抗體滴度和免疫器官的影響

apple12151007 · 發(fā)表于 2010-8-31 14:13:38

板藍(lán)根多糖對(duì)雞新城疫抗體滴度和免疫器官的影響
郭新華[1] 邱妍2 嚴(yán)桂芹 2 周聯(lián)高2

　　摘要：目的：研究板藍(lán)根多糖于與ND疫苗配合使用，對(duì)雞新城疫苗免疫雛雞血清抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù)的影響。方法：150只14日齡蛋公雞隨機(jī)分為3組，板藍(lán)根多糖高、低劑量組，對(duì)照組，各組50羽，同時(shí)設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10羽，14日齡用新城疫Ⅳ系弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻免疫;同時(shí)板藍(lán)根多糖高劑量組(12.3mg·mL- 1)、低劑量組(6.17mg·mL- 1)分別肌肉注射板藍(lán)根多糖0.3mL/羽，對(duì)照組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)三天;免疫后7、14、21、28、35、42d隨機(jī)取8只翼下靜脈采血后分離血清，檢測(cè)雞新城疫HI抗體效價(jià);并于免疫后14、21、28、35、42d隨機(jī)取4只放血致死后稱重，摘取脾臟、胸腺、法氏囊稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。結(jié)論：大多數(shù)試驗(yàn)組雞的抗體效價(jià)與免疫器官指數(shù)都顯著高于對(duì)照組，而且，低劑量組高于高劑量組。

　　關(guān)鍵詞：板藍(lán)根多糖;抗體;免疫器官
　　Abstract: Objection: To study the effection istais root polysaccharide (IRPS) and ND vaccine on NDV HI antibody titer and immune organ.Methods:150 chickens were randomly divided into 3 group , istais root polysaccharide(IRPS) at high and lose group, in control group, each group were 50 chickens, at the same time, each group there are five repetitions, each repetition includes 10 chickens, vaccinated with NDV-IV vaccine at 14 day; At the same time, the chickens in experimental group were intramuscularly injected respectively istais root polysaccharide(IRPS) 0.3ml, in control group,physiological saline,once a day for three successive days; on days 7 , 14, 21,28, 35, 42 after vaccination ,8 chickens’ blood were sample randomly from each group for determination of serum HI antibody titer by micro-method; on days 14, 21, 28, 35, 42 after vaccination, 4 chickens’ weight of whole body, spleen 、thymus and bursa were weighted randomly from each group for calculation of immune organ index.Conclusion:The result showed that most of experimental group chickens’ HI antibody titer and immune organ index both significantly higher control group, also lose group higher high group.
　　Key word:istais root polysaccharide(IRPS); antibody titer; immune organ
　　雞群接種新城疫疫苗后，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)新城疫病例，其主要原因是疫苗保護(hù)率低和某些免疫抑制因素所致。研究表明，一些細(xì)胞因子能增強(qiáng)免疫反應(yīng)，如白介素-2已作為一種新型基因工程免疫增強(qiáng)劑而被廣泛研究。許多中藥成分與疫苗合用，可以增強(qiáng)機(jī)體的非特異性或特異性免疫應(yīng)答，使抗體在血液中或粘膜表面維持更長(zhǎng)時(shí)間，發(fā)揮持久的免疫效果，提高機(jī)體的抗病。板藍(lán)根多糖是板藍(lán)根中的天然有效活性成分，具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能，增加白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞有絲分裂反應(yīng)，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性，誘生干擾素等作用，是較強(qiáng)的免疫刺激劑。對(duì)利用板蘭根多糖的免疫增強(qiáng)作用，與ND疫苗配合使用，來(lái)探討板藍(lán)根多糖對(duì)雞新城疫苗免疫雛雞血清抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù)的影響，旨在研制出一種高效中草藥免疫增強(qiáng)劑，以提高雞對(duì)NDV的免疫力，同時(shí)也為今后中西復(fù)方免疫增強(qiáng)劑的研究提供理論依據(jù)。
　　1試驗(yàn)材料
　　1.1 板藍(lán)根多糖(多糖純度為27%)，由微生物試驗(yàn)室提供。
　　1.2 疫苗新支二聯(lián)弱毒苗、新城疫(NDV-IV)弱毒苗、新支二聯(lián)油苗;雞新城疫HI 測(cè)試抗原(由微生物實(shí)驗(yàn)室提供)。
　　1.3 主要試劑
　　Alsever's血球保存液配制準(zhǔn)確稱取葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.80g、氯化鈉0.42g，溶解于800mL雙蒸水(雙蒸水指的是經(jīng)過(guò)二次蒸餾的水，一般用于實(shí)驗(yàn)，但不能喝，因?yàn)槠渲袑?duì)人體有益的鈣鎂離子已經(jīng)被破壞)中，以0.1%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH為7.2，然后定容至1000mL。用0.22μm濾膜過(guò)濾，再以108℃高壓蒸汽滅菌15分鐘，4℃保存。
　　1.4 雞紅細(xì)胞懸液的制備
　　采集雞外周血5mL，轉(zhuǎn)移到20mLAlsever's血球保存液中，4℃保存(保存時(shí)間不超過(guò)一周)。臨用前，以生理鹽水洗滌3次，每次洗滌后以2000rpm離心5min。最后用生理鹽水調(diào)節(jié)紅細(xì)胞懸液濃度為1%。
　　2試驗(yàn)方法
　　2.1 動(dòng)物分組及處理
　　1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞150只(購(gòu)自孵化廠)，隨機(jī)均分為2個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組50只，同時(shí)設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10羽，14日齡(平均母源抗體效價(jià)4.5 )時(shí)用一羽份的新支二聯(lián)弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻，板藍(lán)根多糖加去離子水稀釋成不同的濃度，同時(shí)高劑量組肌肉注射12.3mg.mL- 1板藍(lán)根多糖溶液0.3mL/羽，低劑量組肌肉注射6.17mg.mL- 1板藍(lán)根多糖溶液0.3mL/羽，對(duì)照組肌肉注射生理鹽水0.3mL/羽，每天1次，連續(xù)三天，24日齡用一羽份的新城疫Ⅳ弱毒苗二免，同時(shí)肌肉注射新支二聯(lián)油苗，0.3mL/羽。
　　分別于免疫后第7( D7)、14 (D14)、21(D21) 、28( D28) 、35(D35)和42(D42)天每組隨機(jī)抽取8羽，翼下靜脈采血，分離血清，用β-微量法檢測(cè)血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI)抗體效價(jià);于免疫后14 (D14)、21(D21) 、28( D28) 、35(D35)和42(D42)天每組隨機(jī)抽取4羽稱重，剖殺，摘取胸腺、脾臟和法式囊并稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)(免疫器官重量/體重×100%)。
　　2.2 雞血清新城疫抗體效價(jià)檢測(cè)
　　2.2.1 4單位抗原的滴定在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50μL PBS液，另加一排作為重復(fù)。再向每排的第1孔加入50μL新城疫尿囊液，依次向后倍比稀釋直至第11孔，第12孔作為對(duì)照，無(wú)抗原液;然后向每孔加入50μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，將微量板在微量振蕩器上震動(dòng)混勻后置于37℃溫箱中感作30min，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時(shí)觀察結(jié)果。
　　結(jié)果判定，孔內(nèi)紅細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀為凝集，呈圓點(diǎn)狀沉于孔底為沉淀。以100%凝集的抗原最大稀釋孔為該抗原血凝價(jià)，即一個(gè)凝集單位;從該孔向前移2孔的抗原稀釋度作為4單位抗原的稀釋度。
　　2.2.2 樣品的檢測(cè) 采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品的抗體效價(jià)，在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50μL PBS液，再向每排的第1孔加入50μL待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12孔，然后向每孔加入50μL 4單位抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20min。取出向每孔加入50μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清及空白對(duì)照空。振蕩混勻后置于37℃溫箱中感作30min，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時(shí)觀察結(jié)果。
　　結(jié)果判定，以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度，每組以8只雞血清抗體滴度的平均值表示該組的抗體水平。
　　2.3 數(shù)據(jù)分析
　　數(shù)據(jù)以Means±SD表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重分析，比較抗體變化和器官指數(shù)變化情況。
　　3 結(jié)果
　　表3-1 板藍(lán)根多糖高低劑量對(duì)雞血清ND-HI抗體效價(jià)的影響
　　Table 3-1 Effect of istais root polysaccharide(IRPS) high and lose on serum ND-HI antibody titer
　　

　　注:同行數(shù)據(jù)沒(méi)有相同字母者差異顯著(P<0.05)。
　　Line data markd without the same superscripts differ significantly (P<0.05).
　　3.1 ND-HI抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化
　　由表3-1可見，試驗(yàn)初期，板藍(lán)根多糖高低劑量組與空白對(duì)照組的新城疫HI抗體滴度差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)第21d，板藍(lán)根多糖低劑量組與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，這種差異顯著性在第28、35、42d仍然維持(P<0.05)，且在試驗(yàn)的35天達(dá)到了最高峰。
　　表3-2板藍(lán)根多糖高低劑量對(duì)雞免疫器官指數(shù)的影響
　　Table 3-2 Effect of istais root polysaccharide(IRPS) high and lose on immune organ index 　　

　　注:同行數(shù)據(jù)沒(méi)有相同字母者差異顯著(P<0.05)。
　　Line data marked without the same superscripts differ significantly (P<0.05).
　　3.2 免疫器官指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化
　　由表3-2可見，免疫后第14、42d，板藍(lán)根多糖高低劑量組的胸腺指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，免疫后第21、28、35d，板藍(lán)根多糖低劑量組的胸腺指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05);免疫后第14、21d或14、28d，板藍(lán)根多糖高低劑量組的脾臟或法氏囊指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，免疫后第35、42d，板藍(lán)根多糖高低劑量組的脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，免疫后第28d或21、35、42d，板藍(lán)根多糖低劑量組的脾臟或法氏囊指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，免疫后第21、35、42d，板藍(lán)根多糖高劑量組的法氏囊指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。
　　4 討論
　　體液免疫是機(jī)體抗御傳染病的主要因素之一，抗體是介導(dǎo)體液免疫的重要分子，在體內(nèi)可發(fā)揮多種免疫功能?？贵w效價(jià)的高低直接反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀態(tài)，它是一種最簡(jiǎn)單方便的方法，因此本試驗(yàn)采用檢測(cè)抗體效價(jià)作為評(píng)價(jià)免疫增強(qiáng)劑增強(qiáng)疫苗的免疫作用的指標(biāo)。多糖作為疫苗免疫增強(qiáng)劑可以促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。據(jù)研究報(bào)道，屈洪巖(1998)等研究了玉米花粉多糖對(duì)雞新城疫弱毒疫苗免疫應(yīng)答的影響，發(fā)現(xiàn)玉米花粉多糖能顯著促進(jìn)ND-HI抗體的產(chǎn)生，使抗體提前產(chǎn)生并維持較高滴度。本試驗(yàn)表明板藍(lán)根多糖能顯著提高蛋公雞的新城疫HI抗體滴度水平，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。
　　胸腺的免疫功能主要是誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化和成熟，胸腺衍化的T細(xì)胞輔助T細(xì)胞產(chǎn)生抗體;防止自身免疫病的發(fā)生，維持機(jī)體自身免疫穩(wěn)定。從而延緩胸腺的萎縮，丁雁(1992)等研究發(fā)現(xiàn)EPS可延緩胸腺的萎縮，且呈劑量依賴關(guān)系。EPS劑量越小，胸腺萎縮越明顯，B細(xì)胞存在于淋巴結(jié)、脾臟等淋巴器官中，其中脾臟中B細(xì)胞約占60%，是抗體產(chǎn)生的主要基地。禽類的B細(xì)胞是由骨髓多功能干細(xì)胞經(jīng)血流進(jìn)入法氏囊后，在囊素的誘導(dǎo)下分化的，經(jīng)淋巴和血液循環(huán)至外周免疫器官的非胸腺依賴區(qū)并繼續(xù)增殖參與體液免疫。由腔上囊分泌的囊素對(duì)B細(xì)胞的分化、成熟具有重要的作用。因此，胸腺、脾臟和法氏囊是禽的重要免疫器官，器官指數(shù)直接反映免疫器官的發(fā)育狀態(tài)。據(jù)研究報(bào)道，楊鐵虹(2001)等研究當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響，結(jié)果在10～100mg/kg劑量范圍內(nèi)，當(dāng)歸多糖增加正常小鼠脾重;張樂(lè)萃(1998)等分別給實(shí)驗(yàn)雞肌注新城疫(ND)黃芪多糖佐劑油乳苗，結(jié)果表明中藥多糖作為新城疫油乳苗佐劑能明顯增加免疫器官的重量，本試驗(yàn)表明板藍(lán)根多糖能通過(guò)影響脾臟、法氏囊的發(fā)育，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而提高機(jī)體抗體水平。與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。
　　總之，本試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了板藍(lán)根多糖的免疫增強(qiáng)功能，本試驗(yàn)的主要目的旨在研制開發(fā)新型免疫增強(qiáng)劑，以提高畜禽傳染病的防治效果，保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展。同時(shí)也為了克服現(xiàn)有佐劑的不足，減少畜禽產(chǎn)品的化學(xué)藥物殘留，提高乳肉蛋的品質(zhì)，保障食品安全和人民健康，無(wú)論對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
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