酶聯(lián)免疫法檢測鹽酸克倫特羅的探討

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　　酶聯(lián)免疫法檢測鹽酸克倫特羅的探討

　　北京市飼料監(jiān)察所 賈 濤

　　摘要：鹽酸克倫特羅酶聯(lián)免疫反應測試盒適用于尿樣、組織和飼料等樣品中克倫特羅殘留的定量檢測。克倫特羅作為一種主要的β-興奮劑應用于畜禽肉制品生產(chǎn)中，用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生長速度。在畜禽產(chǎn)品中過量殘留會對消費者造成危害，因此被禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用。與傳統(tǒng)的HPLC或GC-MS方法相比，酶聯(lián)免疫方法具有操作簡便、靈敏度高、成本低的優(yōu)點。試劑盒方法的特點包括：a.試劑盒的提取方法能達到95%以上的回收率，可以不需用有機溶劑并在10～30min之內(nèi)完成提取過程。b.高靈敏度;低檢測下限。c.檢測過程只需不到2小時。d.高重復性。經(jīng)過試驗研究，酶聯(lián)免疫反應測試盒在檢測鹽酸克倫特羅時，相關系數(shù)(r值)可達到0.99以上，最低檢測限可達到0.05ppb。
　　關健詞：酶聯(lián)免疫 檢測 鹽酸克倫特羅 探討
　　Study of ELISA method test clenbuterol
　　Beijing Supervision Institute of Feed Jiatao
　　Abstract
　　Clenbuterol ELISA Kit is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of clenbuterol and other related β-agonists in animal tissue,meat,animal feed and urine.Clenbuterol is one of major β-agonists illegally used in livestock production.It can improve the meat/fat ratio in fattened animals and accelerate livestock growth. Therefore,excess clenbuterol residues in livestock products may lead to health risks for consumers.This has led to a prohibition of clenbuterol use in food production. The amount of clenbuterol residues can be determined by methods such as HPLC or GC-MS.However,these traditional methods usually require very expensive preparation procedures.Alternatively,enzyme immunoassay (ELISA) can be used as a screening system,which is simple,rapid,sensitive and cost-effective compared with traditional methods.The unique features of the kit are: a.Rapid(10～30minutes),and organic reagent-free extraction method for various samples with high recovery over 95%.b.High sensitivity and low detection limit.c.A quick ELISA assay (less than 2 hours regardless of number of samples.)d.High reproducibility.By research,ELISA KIT method for quantifatioc clenbuterol,LOD is 0.05ng/g,r>0.99.
　　Keywords: ELISA test clenbuterol study
　　前言：鹽酸克倫特羅殘留在動物組織中，人食用后會對肝、腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒害，出現(xiàn)心悸、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、心率加快、肌肉振顫等癥狀，嚴重者甚至死亡。臨床表現(xiàn)為：a. 急性中毒有心悸，面頸、四肢肌肉顫動，有手抖甚至不能站立，頭暈，乏力，原有心律失常的患者更容易發(fā)生反應，心動過速，心室性早搏，心電圖示S-T段壓低與T波倒置。b. 原有交感神經(jīng)功能亢進的患者，如有高血壓、冠心病、甲狀腺功能亢進者上述癥狀更易發(fā)生。c. 與糖皮質(zhì)激素合用可引起低血鉀，從而導致心律失常。d. 反復使用會產(chǎn)生耐受性，對支氣管擴張作用減弱及持續(xù)時間縮短。
　　雖然克倫特羅殘留的毒作用為輕度的，但美國FDA研究表明，應用擬交感神經(jīng)藥者或?qū)η八庍^敏者，對克倫特羅的反應要比正常健康個體更為嚴重。
　　1、毒理簡介
　　克倫特羅是一種β-興奮劑，添加于飼料中能提高幾種家畜包括豬的瘦肉率。由于其在黑市可買到，克倫特羅在歐洲、美國、亞洲非法用于家畜飼料中及飲用水中。在某些國家，非法用過克倫特羅的牛組織中的殘留引起人的中毒。最近報道人食用了含有克倫特羅的豬肉導致中毒。
　　鹽酸克倫特羅(clenbuterol，CLB)是一種平喘藥的商品名，又稱氨哮素、克喘素，化學名稱為羥甲叔丁腎上腺素，或“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽”。中文名稱有：瘦肉精;克倫特羅;鹽酸克倫特羅;鹽酸雙氯醇胺;克喘素;氨哮素;氨必妥;氨雙氯喘通;氨雙氯醇胺。
　　英文名稱有：Clenbuterol; Spiropent;Planipart;NAB365;4-Amino-3,5-dichloro-alpha-[((1,1-dimethylethyl)amino)methyl]benzenemethanol;CAS號：37148-27-9。分子式：C12-H18-Cl2-N2-O。
　　理化特性：白色或類白色的結晶粉末，無臭、味苦，熔點161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。
　　毒理簡介：克倫特羅能激動β2-受體，對心臟有興奮作用，對支氣管平滑肌有較強而持久的擴張作用，口服后較易經(jīng)胃腸道吸收。
　　該藥物可選擇性地作用于腎上腺素受體，是一種強效激動劑，可引起交感神經(jīng)興奮，在藥物劑量下，具有松弛氣管平滑肌作用，用于治療支氣管炎、肺氣腫等引起的哮喘。80年代初，美國一家公司意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅藥物添加在飼料中，可明顯促進動物生長，并增加瘦肉率。隨后，這一新發(fā)現(xiàn)在一些國家被應用于養(yǎng)殖業(yè)。鹽酸克倫特羅進入體內(nèi)后具有分布快、消除慢的特點，能夠改變營養(yǎng)的代謝途徑，促進動物肌肉、特別是骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，抑制脂肪的合成和積累，從而使生長速度加快、瘦肉相對增加。一般來說，飼料中添加適量鹽酸克倫特羅后，可使飼料轉(zhuǎn)化率、生長速率、酮體瘦肉率提高10%以上，所以也稱它為“瘦肉精”?；谑秤脛游飪?nèi)臟而導致的中毒事件的不斷發(fā)生，歐盟很快作出了反映：嚴禁在飼料中添加鹽酸克倫特羅類藥物。美國食品與藥品管理局(FDA)也將肉品中的鹽酸克倫特羅殘留作為必檢項目。FDA和世界衛(wèi)生組織(WHO)還制定了畜產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅的最高殘留限量：動物肌肉中最高限量為0.2ug/kg、肝臟中最高限量為0.6ug/kg、腎臟中最高限量為0.6ug/kg、動物脂肪中最高限量為0.2ug/kg和奶制品中最高限量為0.05ug/kg。至此，“瘦肉精”在動物生產(chǎn)與飼料加工中全面被禁止使用。近年來動物性產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅殘留對人類健康造成的危害和對生態(tài)食物鏈所造成的破壞已經(jīng)引起高度的重視。
　　2、 酶聯(lián)免疫分析技術(EIA)的簡介
　　酶聯(lián)免疫分析技術是“邁向21世紀的醫(yī)學檢驗技術”之一，其發(fā)展趨勢是：新標記物的發(fā)展與聯(lián)合應用、單克隆以及基因工程抗體的應用及免疫放大技術，可明顯提高檢測特異性，靈敏度可達ng/ml水平，即可實現(xiàn)分子水平的檢測。
　　目前，檢測鹽酸克倫特羅較高效的免疫分析技術是ELISA技術。ELISA法可對動物尿液和血清中的β-興奮劑殘留進行直接分析，該方法既適于實驗室大量樣品的檢測，也適于屠宰場地大量樣品的迅速檢測。美國、英國和德國的公司均開發(fā)出了檢測肉品、飼料中CLB殘留的ELISA試劑盒。中國在應用EIA檢測CLB方面的研究起步晚，但近幾年取得了明顯的進展，目前已有幾種試劑盒研制開發(fā)成功。ELISA檢測試劑盒優(yōu)點是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速、價格便宜。
　　3、 試劑盒原理
　　MaxsignalTM鹽酸克倫特羅酶聯(lián)免疫反應測試盒基于競爭性免疫反應原理，含有鹽酸克倫特羅的抗原已經(jīng)包被于微孔板上，吸附在孔內(nèi)的藥物抗原與被測的樣品中藥物競爭性與藥物一抗相結合。當與樣品藥物相結合的藥物抗體被洗滌去除后，只剩下與微孔內(nèi)藥物相結合的抗體，與經(jīng)酶標記的二抗相結合，酶底物在酶作用下產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，加酸終止反應，此時藍色產(chǎn)物就會轉(zhuǎn)化成黃色，在450nm波長測定其吸收值(OD值)。OD值的大小與樣品中克倫特羅的含量成反比。
　　4、 試劑盒與試劑溶液的準備
　　4.1、 試劑盒的組成部分：
　　已包被抗原的酶標板(96孔)，標準溶液(0ppb，0.05ppb，0.15ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb)，鹽酸克倫特羅一抗(15ml)，100倍濃縮偶聯(lián)酶標記二抗體(250ul)，酶標記二抗體稀釋液(20ml)，20倍濃縮工作洗液(28ml)，終止液(20ml)，TMB底物溶液(12ml)，200倍濃縮樣品提取液(25ml)，樣品平衡液(0.5ml)，10倍濃縮PBS溶液(25ml)。
　　4.2、 試劑盒的保存：
　　試劑盒應當在2～8℃的溫度下儲存，有效期為一年，如果超過3個月不使用試劑盒，應將一抗和二抗溶液放置在-20℃的溫度下儲存。
　　4.3、試劑溶液使用前的準備：
　　所有的試劑在使用之前應將其回溫至室溫(約半小時)，并在使用試劑前輕微搖動幾下，以保證合理的濃度。
　　4.3.1、樣品提取液的準備：按1：199的比例配置樣品提取濃縮液和蒸餾水。
　　4.3.2、PBS溶液的準備：按1：9的比例配置PBS濃縮液和蒸餾水。
　　4.3.3、二抗工作液的準備：按1：99的比例配制二抗?jié)饪s液和二抗稀釋液，避光保存。
　　4.3.4、工作洗液的準備：按1：19的比例配置洗滌濃縮液和蒸餾水。
　　5、樣品的提取與前處理
　　5.1、飼料樣品的提取與處理
　　稱取飼料樣品0.5g至50ml離心管中，加入樣品提取液10ml，漩渦振蕩1min，室溫下5000轉(zhuǎn)/min離心5min。移取上清液0.5ml至另一離心管中，覆蓋瓶蓋或封口膜，75℃孵育5min，漩渦振蕩1min，室溫下5000轉(zhuǎn)/min，離心5min。移取上清液0.2ml至安培瓶中，加入5ul樣品平衡液，搖勻，待檢測。
　　5.2、豬尿樣品的前處理
　　量取豬尿樣品5ml，至50ml離心管中，5000轉(zhuǎn)/min離心5min。移取上清液0.2ml、PBS溶液0.8ml至安培瓶中，搖勻，待檢測。
　　5.3、豬飲用水樣品的前處理
　　移取適量豬飲用水樣品至50ml離心管中，5000轉(zhuǎn)/min離心5min。移取上清液0.5ml、PBS溶液0.5ml至安培瓶中，搖勻，待檢測。
　　6、酶聯(lián)免疫反應測試步驟
　　6.1、加入50ul的標準品和樣品所設定的酶標板孔中;
　　6.2、在每孔中加入100ul一抗，輕搖微孔板混勻1min;
　　6.3、室溫下(20～25℃)孵育30min;
　　6.4、洗板3次，每次加入250ul洗液，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干;
　　6.5、每孔加入150ul二抗(避免陽光直射和工作臺溫度過低，孵育時適當覆蓋微孔板);
　　6.6、 室溫下(20～25℃)孵育30min;
　　6.7、 洗板3次，每次加入250ul洗液，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干;
　　6.8、加入100ul的TMB底物溶液(底物本身無色，但加入到酶標板微孔中會出現(xiàn)變化為藍色的反應)，避光培養(yǎng)15min;
　　6.9、加入100ul的反應終止液，在波長450nm的酶標儀下讀OD值。
　　7、檢測結果與分析
　　7.1、 生長育肥豬配合飼料的檢測數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析
　　7.1.1、生長育肥豬配合飼料的檢測數(shù)據(jù)
　　表1、標準曲線

標準濃度(ppb)	濃度對數(shù)	OD450-1	OD450-2	平均OD	相對吸光度
0.00	/	2.326	2.274	2.300	100.0
0.05	1.30	2.107	2.054	2.081	90.5
0.15	0.82	1.741	1.776	1.759	76.5
0.50	0.30	1.297	1.218	1.258	54.7
1.50	0.18	0.886	0.890	0.888	38.6
4.50	0.65	0.616	0.608	0.612	26.6
r=0.9969 斜率=33.7652 截距=46.5785

　　表2、離散系數(shù)

標準濃度(ppb)	檢測個數(shù)	CV(%)
0.00	8	2.6
0.05	8	3.3
0.15	8	2.8
0.50	8	2.4
1.50	8	2.8
4.50	8	2.1

　　表3、陽性添加回收率

標準濃度(ppb)	OD450-1	OD450-2	平均OD	(b/b0)*100	Conc(ppb)	回收率(%)
0.05	2.096	2.082	2.089	90.8	0.049	98.0
0.15	1.701	1.716	1.709	74.3	0.151	100.7
0.50	1.308	1.304	1.306	56.8	0.499	99.8
平均回收率(%)=99.5

　　表4、飼料樣品檢測結果

樣品編號	樣品質(zhì)量(g)	OD-1	OD-2	(b/b0)*100	Conc(ppb)
A1	0.5012	2.908	2.876	125.7	0.090
A2	0.5016	2.920	2.893	126.4	0.087
A3	0.5010	2.611	2.659	114.6	0.194
A4	0.5021	2.696	2.699	117.3	0.161
A5	0.5026	2.762	2.827	121.5	0.121
A6	0.5009	2.889	2.818	124.1	0.101
A7	0.5022	2.734	2.751	119.2	0.141
A8	0.5015	2.887	2.770	123.0	0.109
A9	0.5019	2.909	2.107	109.0	0.283
A10	0.5012	2.795	2.908	124.0	0.102
A11	0.5018	2.785	2.693	119.1	0.142
A12	0.5025	2.715	2.652	116.7	0.168
A13	0.5010	2.754	2.757	119.8	0.136
A14	0.5011	2.805	2.851	123.0	0.109
A15	0.5020	2.800	2.674	119.0	0.143
A16	0.5005	2.705	2.749	118.6	0.148
A17	0.5018	2.791	2.666	118.6	0.147
A18	0.5023	2.793	2.908	123.9	0.102
A19	0.5026	2.646	2.694	116.1	0.175
A20	0.5026	2.792	2.706	119.5	0.138
A21	0.5016	2.728	2.866	121.6	0.120
A22	0.5006	2.817	2.967	125.7	0.090
A23	0.5007	2.707	2.551	114.3	0.197
A24	0.5022	2.760	2.788	120.6	0.128
A25	0.5006	2.691	2.777	118.9	0.145
A26	0.5020	2.820	2.983	126.2	0.088
A27	0.5012	2.746	2.766	119.8	0.135
A28	0.5015	2.704	2.675	116.9	0.165
A29	0.5016	2.728	2.709	118.2	0.151
A30	0.5010	2.880	2.937	126.5	0.086
A31	0.5019	2.735	2.648	117.0	0.164
A32	0.5015	2.207	2.292	97.8	0.608
A33	0.5023	2.713	2.858	121.1	0.124
A34	0.5008	2.957	2.898	127.3	0.081
A35	0.5002	2.726	2.670	117.3	0.161
A36	0.5024	2.684	2.662	116.2	0.173
A37	0.5017	2.687	2.734	117.8	0.155
A38	0.5018	2.847	2.831	123.4	0.106
A39	0.5026	2.636	2.594	113.7	0.206
A40	0.5021	2.691	2.649	116.1	0.175
A41	0.5009	2.753	2.714	118.8	0.145
A42	0.5025	2.874	2.840	124.2	0.100

　　7.1.2、生長育肥豬配合飼料的檢測數(shù)據(jù)分析
　　依據(jù)農(nóng)業(yè)部所指定的方法“NY438-2001飼料中鹽酸克倫特羅的測定”中規(guī)定的最低檢測限為0.01mg/kg，當測定結果小于0.01mg/kg時，判定為“陰性”，檢測結果按“未檢出”計，反之按“NY438-2001”處理。
　　把0.01mg/kg換算成以ppb為單位是10ppb。飼料在前處理過程中被稀釋20倍，表4所列出的濃度值(conc)是經(jīng)過酶聯(lián)免疫分析檢測軟件處理后的最終濃度值，表中所列出是數(shù)值是已經(jīng)乘以稀釋倍數(shù)后的濃度值。
　　通過表4可以看出，對檢測的飼料樣品均小于“NY438-2001”所規(guī)定的10ppb，檢測結果均按未檢出計?？梢苑磻?，目前市場上的生長育肥豬飼料中沒有添加瘦肉精，飼料質(zhì)量安全可靠。通過表1可知標準曲線的斜率(r值)達到0.9969，高于規(guī)定的0.98;表2可以看出離散系數(shù)(CV值)不高于3.3%;表3可以看出陽性添加回收率平均達到99.5%，高于試劑盒中所規(guī)定的75～95%的回收率數(shù)值;表明此次檢測準確可靠。
　　7.2、 生長育肥豬豬尿的檢測數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析
　　7.2.1、生長育肥豬豬尿的檢測數(shù)據(jù)
　　表5、標準曲線

標準濃度(ppb)	濃度對數(shù)	OD450-1	OD450-2	平均OD	相對吸光度
0.00	/	3.452	3.512	3.482	100.0
0.05	1.30	3.376	3.318	3.347	96.1
0.15	0.82	2.783	2.800	2.792	80.2
0.50	0.30	1.934	2.049	1.992	57.2
1.50	0.18	1.260	1.322	1.291	37.1
4.50	0.65	0.843	0.816	0.830	23.8
r=0.9975 斜率=38.2710 截距=46.6559

　　表6、離散系數(shù)

標準濃度(ppb)	檢測個數(shù)	CV(%)
0.00	8	2.5
0.05	8	3.6
0.15	8	2.8
0.50	8	2.4
1.50	8	2.8
4.50	8	2.6

　　表7、回收率

標準濃度(ppb)	OD450-1	OD450-2	平均OD	(b/b0)*100	Conc(ppb)	回收率(%)
0.05	3.366	3.358	3.362	96.6	0.050	100.0
0.15	2.775	2.728	2.752	79.0	0.143	95.3
0.50	2.056	1.989	2.023	58.1	0.503	100.6
平均回收率(%)=98.6

　　表8、豬尿樣品檢測結果

樣品編號	OD-1	OD-2	(b/b0)*100	Conc(ppb)
B1	3.584	3.661	104.0	0.158
B2	3.368	3.634	100.5	0.195
B3	3.471	3.533	100.6	0.195
B4	3.617	3.571	103.2	0.166
B5	3.462	3.448	99.2	0.212
B6	3.550	3.415	100.0	0.202
B7	3.375	3.351	96.6	0.248
B8	3.556	3.358	99.3	0.211
B9	3.592	3.610	103.4	0.164
B10	3.562	3.571	102.4	0.174
B11	3.322	3.375	96.2	0.254
B12	3.324	3.472	97.6	0.233
B13	3.724	3.749	107.3	0.130
B14	3.663	3.776	106.8	0.134
B15	3.412	3.474	98.9	0.216
B16	3.477	3.547	100.9	0.192
B17	3.540	3.606	102.6	0.173
B18	3.524	3.554	101.6	0.183
B19	3.709	3.801	107.8	0.126
B20	3.705	3.691	106.2	0.139
B21	3.829	3.743	108.7	0.119
B22	3.698	3.685	106.0	0.141
B23	3.682	3.448	102.4	0.175
B24	3.562	3.694	104.2	0.157
B25	3.714	3.738	107.0	0.132
B26	3.657	3.753	106.4	0.137
B27	3.390	3.546	99.6	0.207
B28	3.663	3.525	103.2	0.166
B29	3.405	3.529	99.6	0.207
B30	3.644	3.589	103.9	0.160
B31	3.546	3.525	101.5	0.184
B32	3.691	3.822	107.9	0.126
B33	3.824	3.749	108.7	0.119
B34	3.706	3.840	108.4	0.122
B35	3.735	3.654	106.0	0.141
B36	3.692	3.648	105.4	0.146
B37	3.513	3.580	101.9	0.181
B38	3.696	3.726	106.6	0.136

　　7.2.2、生長育肥豬豬尿的檢測數(shù)據(jù)分析
　　依據(jù)國家所定的推薦標準“GB/T5009.192-2003”中第三法規(guī)定的最低檢測限量為0.5ug/kg，當測定結果小于0.5ug/kg時，判定為“陰性”，檢測結果按“未檢出計”，反之按“GB/T5009.192-2003”第一法處理。
　　把0.5ug/kg換算成以ppb為單位是0.5ppb。生長育肥豬豬尿樣品在前處理過程中被稀釋5倍，表8所列出的濃度值(conc)是經(jīng)過酶聯(lián)免疫分析檢測軟件處理后的最終濃度值，表中所列出是數(shù)值是已經(jīng)乘以稀釋倍數(shù)后的濃度值。
　　通過表8可以看出，對檢測的生長育肥豬豬尿樣品均小于“GB/T5009.192-2003”所規(guī)定的0.5ppb，檢測結果均按未檢出計?？梢苑磻觯壳吧i的養(yǎng)殖企業(yè)所生產(chǎn)的肉制品質(zhì)量安全可靠。通過表5可知標準曲線的斜率(r值)達到0.9975，高于規(guī)定的0.98;表6可以看出離散系數(shù)(CV值)不高于3.6%;表7可以看出陽性添加回收率平均達到98.6%，高于試劑盒中所規(guī)定的75～95%的回收率數(shù)值;表明此次檢測準確可靠。
　　7.3、生長育肥豬飲用水的檢測數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析
　　7.3.1、生長育肥豬飲用水的檢測數(shù)據(jù)
　　表9、標準曲線

標準濃度(ppb)	濃度對數(shù)	OD450-1	OD450-2	平均OD	相對吸光度
0.00	/	3.558	3.563	3.561	100.0
0.05	1.30	3.372	3.365	3.369	94.6
0.15	0.82	2.825	2.837	2.831	79.5
0.50	0.30	1.960	2.071	2.016	56.6
1.50	0.18	1.275	1.336	1.306	36.7
4.50	0.65	0.852	0.825	0.839	23.6
r=0.9973 斜率=37.7147 截距=46.1449

　　表10、離散系數(shù)

標準濃度(ppb)	檢測個數(shù)	CV(%)
0.00	8	2.6
0.05	8	3.5
0.15	8	2.7
0.50	8	2.4
1.50	8	2.4
4.50	8	2.6

　　表11、回收率

標準濃度(ppb)	OD450-1	OD450-2	平均OD	(b/b0)*100	Conc(ppb)	回收率(%)
0.05	3.396	3.412	3.404	95.6	0.049	98.0
0.15	2.756	2.768	2.762	77.6	0.147	98.0
0.50	2.020	2.066	2.043	57.4	0.504	100.8
平均回收率(%)=98.9

　　表12、生長育肥豬飲用水樣品檢測結果

樣品編號	OD-1	OD-2	(b/b0)*100	Conc(ppb)
C1	3.728	3.736	104.8	0.056
C2	3.532	3.580	99.9	0.075
C3	3.721	3.650	103.5	0.060
C4	3.574	3.521	99.6	0.076
C5	3.746	3.728	105.0	0.055
C6	3.164	3.105	88.0	0.155
C7	3.758	3.710	104.9	0.055
C8	3.597	3.586	100.9	0.071
C9	3.661	3.620	102.2	0.065
C10	3.488	3.476	97.8	0.085
C11	3.660	3.628	102.3	0.065
C12	3.718	3.756	105.0	0.055
C13	3.799	3.729	105.7	0.053
C14	3.422	3.518	97.5	0.087
C15	3.549	3.466	98.5	0.082
C16	3.506	3.518	98.6	0.081
C17	3.474	3.429	96.9	0.090
C18	3.466	3.406	96.5	0.092
C19	3.377	3.327	94.1	0.107
C20	3.480	3.416	96.8	0.091
C21	3.368	3.320	93.9	0.108
C22	3.572	3.524	99.6	0.076
C23	3.807	3.767	106.4	0.051
C24	3.815	3.835	107.4	0.047
C25	3.730	3.698	104.3	0.057
C26	3.760	3.750	105.5	0.053
C27	3.183	3.126	88.6	0.150
C28	3.624	3.594	101.4	0.069
C29	3.653	3.621	102.1	0.065
C30	3.723	3.711	104.4	0.057
C31	3.727	3.701	104.3	0.057
C32	3.744	3.758	105.4	0.054
C33	3.661	3.649	102.7	0.063
C34	3.736	3.762	105.5	0.054
C35	3.521	3.496	98.5	0.082
C36	3.630	3.652	102.3	0.065
C37	3.518	3.522	98.9	0.080
C38	3.369	3.327	94.0	0.107

　　7.3.2、生長育肥豬飲用水的檢測數(shù)據(jù)分析
　　參照 “NY438-2001飼料中鹽酸克倫特羅的測定”中規(guī)定的最低檢測限為0.01mg/kg，當測定結果小于0.01ug/ml時，判定為“陰性”，檢測結果按“未檢出”計，反之按“NY438-2001”處理。
　　把0.01ug/ml換算成以ppb為單位是10ppb。生長育肥豬飲用水樣品在前處理過程中被稀釋2倍，表12中所列出的濃度值(conc)是經(jīng)過酶聯(lián)免疫分析檢測軟件處理后的最終濃度值，表中所列出是數(shù)值是已經(jīng)乘以稀釋倍數(shù)后的濃度值。
　　通過表12可以看出，對檢測的生長育肥豬飲用水樣品均小于“NY438-2001”所規(guī)定的10ppb，檢測結果均按未檢出計?？梢苑磻?，目前的生豬養(yǎng)殖企業(yè)沒有向生長育肥豬飲用水中添加瘦肉精。通過表9可知標準曲線的斜率(r值)達到0.9973，高于規(guī)定的0.98;表10可以看出離散系數(shù)(CV值)不高于3.5%;表11可以看出陽性添加回收率平均達到98.9%，高于試劑盒中所規(guī)定的75～95%的回收率數(shù)值;表明此次檢測準確可靠。
　　8. 討論
　　8.1、不同批次的試劑盒不能混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。確保二抗及二抗稀釋液的正確配制才能達到準確無誤的效果。
　　8.2、檢測過程中應盡量保持室溫20～25℃，避免在通風口操作防止溫度過低、過熱或蒸發(fā)都會影響檢測數(shù)據(jù)的準確性。同樣不應在陽光直射下實驗，防止過熱或蒸發(fā)帶來的影響，陽光直射下操作，還會給二抗、一抗溶液與吸附在試劑盒微孔的抗原的酶聯(lián)免疫反應起到不利影響。
　　8.3、在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應適當鋪墊若干紙巾或其它物料。
　　8.4、水質(zhì)對檢測結果的影響很重要，應確保使用蒸餾水或者去離子水。
　　8.5、加入樣品或者試劑到微孔板時，吸嘴靠于微孔板壁，盡量接近微孔底部，但不應接觸到底部，以免劃傷吸附在微孔內(nèi)的抗原。
　　8.6、孵育時間的計算越規(guī)范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品，有利于檢測結果的準確性。
　　8.7、從低濃度到高濃度地添加標準品，可降低影響標準曲線質(zhì)量的風險。
　　參考文獻(引用標準)：
　　1、 中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，飼料中鹽酸克倫特羅的測定，Determination of clenbuterol hydrochloricde in feed，NY438-2001，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2001-02-12發(fā)布。
　　2、 中華人民共和國國家標準，動物性食品中克倫特羅殘留量的測定，Determination of 4-amino-3,5-dichloro-α[(tert-butylamino)methyl]-benzyl alcohol (clentuterol) residues in animal foods，GB/T5009.192-2003,中華人民共和國衛(wèi)生部/中國國家標準化管理委員會2003-08-11發(fā)布。
　　3、 中華人民共和國國家標準，飼料釆樣，F(xiàn)eeding stuffs-sampling，GB/T14699.1-2005，中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標準化管理委員會2005-03-23發(fā)布。
　　4、 中華人民共和國國家標準，分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法，Water for analytical laboratory use-specification and test methods，GB6682-92，國家技術監(jiān)督局1992-06-29發(fā)布。
　　注：此篇論文沒有引用參考文章與論文，上面所引用的國家標準可視作參考文獻。
　

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