米曲霉、黑曲霉發(fā)酵紅三葉草對異黃酮的影響研究

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　　米曲霉、黑曲霉發(fā)酵紅三葉草對異黃酮的影響研究
　　陳鳳風(fēng) 成文曉 張福元
　　摘 要 本研究利用引進(jìn)的產(chǎn)纖維素酶活高的米曲霉菌株1、2和黑曲霉3.3148，對紅三葉草固態(tài)發(fā)酵，通過比較不同菌發(fā)酵處理后酒精提取物在不同紫外波段吸光度曲線，研究了其對異黃酮結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：米曲霉菌株2對異黃酮結(jié)構(gòu)有很大的破壞作用，而米曲霉菌株1和黑曲霉3.3148對其無影響。
　　關(guān)鍵詞 紅三葉 米曲霉、黑曲霉 異黃酮
　　紅三葉 (Red Clover)為豆科多年生草本植物，又名紅花苜蓿、紅菽草、紅荷蘭翹搖、金雀菜等，屬車軸草屬(TrifolIUm L.)[1]。紅三葉草原產(chǎn)于小亞西亞和西南歐，在歐洲各國及俄羅斯、澳大利亞、新西蘭、美國等國海洋性氣候地區(qū)廣泛栽培。紅三葉草在我國新疆、吉林、云貴高原、北鄂西山地都有野生，另外我國江淮流域、華北、華南、西南等地均有栽培，是一種優(yōu)良的豆科牧草[2]。
　　紅三葉草主要含有異黃酮、維生素、氨基酸、糖類和等多種生物活性成分，其中異黃酮是紅三葉草中特殊的活性成分[3]。
　　異黃酮具有多種生理活性,概括起來主要有兩個(gè)方面：即植物雌激素功能和抗氧化功能[4、5、6]。
　　異黃酮在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物的雌激素——雌二醇相似,都具有雌激素的活性，它可與生物體內(nèi)雌激素受體ER結(jié)合而表現(xiàn)出一定的雌激素功能。由于異黃酮活性組分與ER的結(jié)合力和甾體雌激素與ER的結(jié)合力相比低近千倍,因此,其結(jié)合后的潛在健康效應(yīng)存在U型劑量-效應(yīng)關(guān)系,即低劑量時(shí)由于它與雌激素競爭結(jié)合ER而降低了雌激素活性,因而表現(xiàn)為抗雌激素作用;而中劑量時(shí)可產(chǎn)生一定的雌激素活性;高劑量時(shí),補(bǔ)充的異黃酮?jiǎng)t可活化因雌激素水平限制而未能活化的ER,產(chǎn)生雌激素增強(qiáng)效應(yīng)。這種U型劑量-效應(yīng)關(guān)系使得異黃酮具有雌激素樣的多種功能[7、8、9、10]。
　　在生產(chǎn)中應(yīng)用有顯著的效果：
　　(1).提高繁殖性能和提高泌乳性能，張榮慶和韓正康 [11]通過研究證實(shí),大豆異黃酮可以顯著提高二花臉母豬在試驗(yàn)初期的泌乳量。
　　(2).提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能，劉燕強(qiáng)等[12]將320日齡羅曼蛋雞隨機(jī)均分為對照組,喂基礎(chǔ)日糧-和試驗(yàn)組,基礎(chǔ)日糧中添喂大豆異黃酮 3mg/kg，結(jié)果試驗(yàn)組產(chǎn)蛋率顯著提高，且蛋重和飼料轉(zhuǎn)化率也有所提高，表明大豆異黃酮可能通過調(diào)控血液激素水平而提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能。馬學(xué)會(huì)[13]等研究：飼糧添加大豆黃酮可增加蛋殼厚度和蛋殼重，降低破蛋率，改善蛋殼品質(zhì)。
　　(3).提高肉雞生產(chǎn)性能，郭曉紅等 [14]分別在肉仔雞日糧中添加大豆異黃酮5、10、15mg/kg,結(jié)果表明,添加大豆異黃酮可顯著增加肉公雞的平均體增重、飼料效率及平均日采食量。添加量為10mg/kg效果最好。飼料利用率和平均日采食量較對照組均顯著提高(P<0.05)。還有報(bào)道異黃酮能夠提高奶牛的產(chǎn)奶性能和肉牛的生長性能。因此，異黃酮可作為畜禽生長促進(jìn)劑。后來的研究結(jié)果表明這類物質(zhì)還具有強(qiáng)心、降血脂、對抗性激素依賴性腫瘤生長和抗癌等作用。鑒于此，我們利用米曲霉、黑曲霉固態(tài)發(fā)酵紅三葉草產(chǎn)高活性的纖維素酶的同時(shí)，首先有必要研究其對異黃酮的影響。
　　1.材料與儀器
　　1.1試驗(yàn)材料
　　紅三葉草：購自甘肅岷海制藥有限公司，40目粉碎。
　　米曲霉菌株1：引自山西農(nóng)大食品學(xué)院
　　米曲霉菌株2(Aspergillus oryzae var. effusus 3.2824)：購于中國普通微生物保藏管理中心
　　黑曲霉(Aspergillus.niger 3.3148) ：購于中國普通微生物保藏管理中心
　　鷹嘴豆素標(biāo)準(zhǔn)品：購于天津尖峰天然產(chǎn)物研究所
　　1.2儀器設(shè)備
　　生化培養(yǎng)箱：LRH-250A，廣東省醫(yī)療器械廠
　　高壓滅菌鍋：中國上海醫(yī)療器械廠
　　搖床：TZ-ZBH臺(tái)式恒溫振蕩器，北京沃德創(chuàng)意技貿(mào)有限責(zé)任公司(250mL三角瓶用)
　　超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司
　　干燥箱：101-A型，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠
　　電子天平：Adventurer OHAUS
　　植物粉碎機(jī)：江蘇省東臺(tái)市電器廠
　　電熱恒溫水浴鍋：江蘇省東臺(tái)市電器廠
　　紫外可見分光光度計(jì)：UV2100 尤尼克 上海儀器有限公司
　　500ml三角瓶、棉塞、牛皮紙等
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1菌種的制備
　　馬鈴薯葡萄糖斜面試管培養(yǎng)基(PDA)
　　將馬鈴薯洗凈去皮,稱取200g,切成小塊,放入1000ml水中煮沸至土豆塊變軟,用紗布過濾，在濾液中加入稱好的20g瓊脂,不斷攪拌至瓊脂完全溶化,然后加入20g葡萄糖,攪拌至溶解,停止加熱補(bǔ)足水分至1000ml,分裝于試管,包裝,121℃高壓蒸汽滅菌30min，趁熱擺好斜面，備用。
　　將米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種于上述培養(yǎng)基，27℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿試管，備用。
　　2.2紅三葉草發(fā)酵物的制備：
　　稱取20g紅三葉草粉于500ml三角瓶，加水40ml,攪勻，蓋好棉塞,外包牛皮紙，121℃高壓蒸汽滅菌45min。冷卻后于無菌條件下接2.1中備好的各菌種。每個(gè)菌種重復(fù)3瓶，于27℃培養(yǎng)至菌絲長滿2周后取出，干燥后40目粉碎待測。
　　2.3鷹嘴豆素標(biāo)準(zhǔn)物紫外吸收曲線圖的制作
　　精確稱取鷹嘴豆素5.2mg，用無水酒精定容于50ml容量瓶中。量取1ml于25ml容量瓶用無水酒精定容后，在230-300nm不同的波長測吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)物鷹嘴豆素的吸收峰圖如下：
　　
　　Fig.1 The curve diagram of biochanin’s absorptance on different waveband
　　注：鷹嘴豆素在262nm處有最大吸收值
　　2.4紅三葉草和發(fā)酵基質(zhì)酒精提取物不同波段吸收峰圖的制作：
　　準(zhǔn)確稱取紅三葉干粉和經(jīng)米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉發(fā)酵后烘干物1g，裝于濾紙包內(nèi)，置于索氏抽提管，用無水酒精90℃條件下提取完全，將索氏儀底部的圓瓶內(nèi)提取物全部轉(zhuǎn)移到200ml容量瓶內(nèi)，定容后在230-300nm測吸光值，制得酒精提取物在不同波段的吸光值曲線圖如下：
　　
　　Fig.2 The curve diagram of alcoholic extractions ’absorptance by different waweband
　　3 結(jié)果與分析
　　由圖2結(jié)合圖1知：紅三葉草無水酒精提取物在260nm處有最大吸收值，經(jīng)黑曲霉3.3148、米曲霉菌株1發(fā)酵后的紅三葉酒精提取物在波長為260nm左右仍有最大吸收值，而且與未發(fā)酵紅三葉草酒精提取物的不同波段吸收曲線極為相似，可以推斷酒精提取物主要成分沒有變化，而經(jīng)米曲霉2發(fā)酵的紅三葉的酒精提取物在250-270nm波段內(nèi)沒有最大吸收值，其波段-吸光度曲線幾乎成為一直線，說明紅三葉草經(jīng)米曲霉菌株2發(fā)酵后的酒精提取物成分發(fā)生了很大變化。結(jié)合舒淑等高效液相色普法檢測大豆異黃酮和陳封政等紅三葉中總異黃酮含量的測定的報(bào)道，酒精提取物內(nèi)主要成分為異黃酮[34、35、36、37]，可以推斷米曲霉菌株2降解了紅三葉草內(nèi)異黃酮。
　　4結(jié)論
　　米曲霉菌株2為米曲霉變種，雖然其產(chǎn)纖維素酶活高，但通過對紅三葉的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)其不利于異黃酮的應(yīng)用，因此選擇米曲霉菌株1、黑曲霉3.3148做進(jìn)一步研究。
　　作者簡介：陳鳳風(fēng) 成文曉，山西農(nóng)大碩士研究方向：生物飼料工程
　　張福元：山西農(nóng)大動(dòng)物科技學(xué)院，教授

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