纖維素酶

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　　纖維素是地球上最廉價(jià)、最豐富的可再生資源。全世界每年的植物體生成量高達(dá)1500億噸干物質(zhì)，其中纖維素及半纖維素的總量為850億噸。但由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶構(gòu)造，其外圍又被木質(zhì)素包圍著，要把它水解成可利用的葡萄糖相當(dāng)困難，所以到目前為止仍未能得到很好地利用。隨著世界人口的驟增，資源面臨短缺的危機(jī)。如何有效的利用纖維資源對(duì)解決環(huán)境污染、食品短缺及能源危機(jī)等具有重大現(xiàn)實(shí)意義。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶(cellulase)來分解和轉(zhuǎn)化纖維素則是纖維素利用的有效途徑，故對(duì)纖維素酶的研究越來越引起人們的重視。纖維素酶于1904年在蝸牛消化液中最先被人們所發(fā)現(xiàn)，1945年在微生物中發(fā)現(xiàn)了此酶，此后，纖維素酶的研究和應(yīng)用便逐步受到世界各國的關(guān)注。纖維素酶作為飼料添加劑始于20世紀(jì)70年代，我國也從這一時(shí)期開始進(jìn)行初步的纖維素酶研究工作，近二十年來，進(jìn)行了開發(fā)性研究工作，并應(yīng)用到飼料工業(yè)中，取得了一定的效果。下面主要就纖維素酶的結(jié)構(gòu)、功能特性、應(yīng)用研究現(xiàn)狀及前景作一綜述。
　　1 纖維素酶的組成與分類
　　纖維素酶是指能降解纖維素的一類酶的總稱，是一個(gè)由多種水解酶組成的復(fù)雜酶系，主要來自于真菌和細(xì)菌。根據(jù)各酶功能的不同主要分為三類：1、葡聚糖內(nèi)切酶(1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，E.C3.2.1.4，來自于真菌簡稱為EG;來自于細(xì)菌簡稱為Len)，這類酶一般作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。2、葡聚糖外切酶(1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucanase，E.C3.2.1.91，來自于真菌簡稱Cbh;來自于細(xì)菌簡稱Cex)，這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)。3、β-葡聚糖苷酶(β-1，4-glucosidase, E.C3.2.1.21，簡稱BG)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。
　　2 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)與功能
　　纖維素酶分子普遍具有類似的結(jié)構(gòu)，均由催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domains,CD)、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose-binding domains, CBD)和連接橋(linker)三部分組成。(1)催化結(jié)構(gòu)域：呈球形，主要體現(xiàn)酶的催化活性及對(duì)特定水溶性底物的特異性。內(nèi)切酶的活性位點(diǎn)位于一個(gè)開放的裂口(cleft)中，它可結(jié)合在纖維素鏈的任何部位并切斷纖維素鏈。外切酶的活性位點(diǎn)位于一個(gè)長環(huán)狀通道中，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。(2)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域：CBD在纖維素酶中位于肽鏈的氨基端或羧基端，通過連接橋與催化結(jié)構(gòu)域相連。1995年，Tomme(1995)根據(jù)CBD分子大小及氨基酸的相似性將已知的CBD分成了10個(gè)家族，大部分的CBD位于家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。人們推測(cè)，CBD可能通過芳香環(huán)與葡萄糖環(huán)的堆積力吸附到纖維素上，由CBD上其余的氫鍵形成殘基與相鄰葡萄糖鏈從纖維素表面脫離開來，以利于催化區(qū)的水解作用。但有一些纖維素酶并沒有CBD，如熱纖梭菌是依靠纖維素酶系中的纖維小體(celluosome)吸附纖維素的。(3)連接橋：連接橋主要是保持CD和CBD之間的距離，也可能有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體。細(xì)菌纖維素酶的連接橋富含脯氨酸、蘇氨酸，而真菌纖維素酶的連接橋富含甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。細(xì)菌纖維素酶的CBD與CD夾角為135度，而真菌為180度;細(xì)菌纖維素酶有兩個(gè)酶切位點(diǎn)可將CBD與連接橋分別切去，而真菌纖維素酶一般只有一個(gè)酶切位點(diǎn)可將CBD與連接橋一同切去。
　　3 纖維素酶的來源和生產(chǎn)
　　3.1 微生物來源
　　3.1.1 真菌源
　　所有能分解晶體纖維素的真菌，均能或多或少的分泌纖維素酶，所以纖維素酶的真菌性來源非常廣泛。目前研究和生產(chǎn)中采用的菌種大多是木霉、曲霉和青霉等。有人綜述了纖維素酶的來源，認(rèn)為綠色木霉的得率最高。目前研究的熱點(diǎn)之一是通過對(duì)已知纖維素酶產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，以增加產(chǎn)酶微生物菌種，國內(nèi)外已有很多這方面的研究報(bào)道，如Mandels等(1971)通過綠色木霉QM6a獲得了QM9123，使活力提高一倍;上海植生所纖維素酶組采用野生木霉As3.3002和擬康氏木霉，經(jīng)物理、化學(xué)因子誘變，獲得了高活力菌株Ea3-967和N2-78。利用基因工程手段也是提高纖維素酶產(chǎn)量和質(zhì)量的重要方法。通過克隆出真菌的纖維素酶基因，將其與高效表達(dá)基因的啟動(dòng)子和染色體起始位點(diǎn)融合則可表達(dá)，并且表達(dá)量增加;同時(shí)利用基因工程手段對(duì)纖維素酶分子進(jìn)行改造，增加其活性并提高耐受性。
　　3.1.2 細(xì)菌源
　　能分解纖維素的細(xì)菌如纖維粘菌、熱纖梭菌及纖維桿菌等亦能分泌纖維素酶。但由于細(xì)菌分泌的纖維素酶量少(低于0.1g/L)，且產(chǎn)生的酶屬胞內(nèi)酶或粘附在細(xì)胞壁上，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，所以很少用細(xì)菌作為纖維素酶的生產(chǎn)菌種。不過近年來國外利用纖維桿菌深層通氣培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素酶效果較好。
　　3.2 動(dòng)物性來源
　　反芻動(dòng)物能消化纖維類飼料，主要由于其瘤胃內(nèi)的微生物能分泌纖維素酶。因此可以利用瘤胃液獲得纖維素酶的粗酶制劑。國內(nèi)外已進(jìn)行了這方面的研究工作，但還沒能應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)中來。
　　3.3 工業(yè)生產(chǎn)
　　纖維素酶的都是通過發(fā)酵生產(chǎn)的。目前所用菌種主要是綠色木霉、李氏木霉、根霉、青霉、反芻動(dòng)物(瘤胃細(xì)菌、真菌)、嗜纖細(xì)菌、產(chǎn)黃單孢菌、側(cè)孢菌等，其中綠色木霉應(yīng)用最廣。纖維素酶是一類胞外酶，從培養(yǎng)物濾液中很容易得到，它又屬于誘導(dǎo)酶，在誘導(dǎo)物存在下才能大量產(chǎn)生。許多不溶性纖維素、可溶性纖維素衍生物、一些低聚糖及某些單糖和二糖均可作為誘導(dǎo)物。研究發(fā)現(xiàn)，在分批培養(yǎng)物發(fā)酵過程中，起初pH值最好是自然下降到3.0~3.5，再加以控制以防止pH降低，消耗纖維素后自然上升，這樣有利于酶的大量分泌。連續(xù)培養(yǎng)時(shí)保持pH=5.0可提高酶產(chǎn)量，因?yàn)榈蚿H會(huì)抑制菌的生長。以前一些國家采用固體曲法生產(chǎn)纖維素酶，但此法難于監(jiān)控，不利于現(xiàn)代化流水作業(yè)。因此現(xiàn)多采用液體深層發(fā)酵。在此基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了流加培養(yǎng)法、分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法、二次發(fā)酵法及細(xì)胞循環(huán)法等。新近又在研究混合微生物發(fā)酵法。因?yàn)椴煌婢睦w維素酶系在各組分均衡性方面有互補(bǔ)的現(xiàn)象，因此如將幾類菌混合在一起發(fā)酵，尋求使它們均能大量分泌纖維素酶的發(fā)酵條件和方法，就可以生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)高效的混合纖維素酶。
　　4 纖維素酶的作用機(jī)理
　　4.1 纖維素酶的降解機(jī)理
　　Reese在1980年提出了C1-CX假說，該假說認(rèn)為由于天然纖維素的特異性必須以不同的酶協(xié)同作用才能將其分解。協(xié)同作用一般認(rèn)為是內(nèi)切葡萄糖酶首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成外切纖維素酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶再水解纖維二糖單位，形成葡萄糖。一般認(rèn)為，協(xié)同作用與酶解底物的結(jié)晶度成正比，當(dāng)酶組分的混合比例與霉菌發(fā)酵液中各組分比相近時(shí)，協(xié)同作用最大，不同菌源產(chǎn)生的內(nèi)切與外切酶之間也具有協(xié)同作用。
　　目前最易為人們所接受的纖維素酶降解作用機(jī)理為：
　　4.2 纖維素酶的營養(yǎng)作用機(jī)理
　　4.2.1 摧毀植物細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)養(yǎng)分
　　植物細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)由植物細(xì)胞壁包裹，植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠組成。纖維素酶可在半纖維素酶、果膠酶等協(xié)同作用下破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來，以有利于進(jìn)一步降解，提高吸收率，同時(shí)也增加了非淀粉多糖的消化進(jìn)而改善了高纖維飼料的利用率。
　　4.2.2 補(bǔ)充動(dòng)物內(nèi)源酶的不足，剌激內(nèi)源酶的分泌質(zhì)的吸收
　　纖維素酶具有維持小腸絨毛形態(tài)完整，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的功能。
　　4.2.3 緩解或消除飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響
　　果膠、半纖維素、β-葡聚糖及戊聚糖能部分溶解于水中，并產(chǎn)生粘性，增加了動(dòng)物胃腸道內(nèi)容物的粘度，對(duì)內(nèi)源酶來說是一個(gè)屏障，降低了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。而補(bǔ)充纖維素酶后，能在半纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖等的協(xié)助下將纖維素、半纖維素、果膠、戊糖等大分子物質(zhì)降解為單糖和寡糖，從而降低粘稠度，促進(jìn)內(nèi)源酶的擴(kuò)散，增加養(yǎng)分的消化吸收。
　　4.2.4 促進(jìn)小腸對(duì)營養(yǎng)物
　　5 纖維素酶在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用
　　5.1 應(yīng)用方法
　　由于植物細(xì)胞壁成分非常復(fù)雜，單一纖維素酶并不能很好的降解植物纖維素。在實(shí)際生產(chǎn)中通常將纖維素酶與半纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶等組成復(fù)合酶制劑，以取得更好的應(yīng)用效果。目前，主要有兩種應(yīng)用方法：(1)體外酶解法：把纖維素酶與秸桿或其他粗飼料拌勻后，在一定的溫度、濕度和pH值下堆積或密封發(fā)酵一定時(shí)間后，晾干或直接飼喂動(dòng)物;(2)體內(nèi)酶解法：把纖維素酶以添加劑的形式加入飼料中拌勻后飼喂動(dòng)物，借助動(dòng)物消化道的內(nèi)環(huán)境而發(fā)揮作用。
　　5.2 應(yīng)用效果
　　大量試驗(yàn)研究表明，飼料中添加纖維素酶對(duì)各種動(dòng)物的飼喂效果十分顯著。尹清強(qiáng)等在荷斯坦奶牛日糧中添加50g/頭的纖維素酶，使產(chǎn)奶量提高了8.9%，飼料轉(zhuǎn)化率提高10%。前蘇聯(lián)學(xué)者在綿羊日糧中加入0.25%的纖維素酶，可明顯提高日增重、粗纖維消化率和羊毛產(chǎn)量。許梓榮等(1999)在含30%麩皮的肉雞日糧中添加β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶，使日增重提高9.79%，飼料轉(zhuǎn)化率改善4.76%，干物質(zhì)、粗纖維、粗脂肪和粗灰分的消化率分別提高10.58%、25.90%、21.76%和7.12%。秦江帆等(1996)在肉仔雞日糧中提高富含纖維的麥麩比例，并添加纖維素酶研究其效果，發(fā)現(xiàn)纖維素酶對(duì)肉仔雞的生長尤其是前期有明顯的促進(jìn)作用。徐奇友等(1998)在13~20周育成期蛋雞日糧(含35%麩皮)中添加0.5%纖維素酶，使增重提高6.29%，飼料轉(zhuǎn)化率提高2.46%。Kee等(1985)在含20%麩皮的肉雞日糧中添加0.08%的纖維素酶，顯著降低了飼料消耗，改善了飼料轉(zhuǎn)化率。Qureshi等(1980)在大麥基礎(chǔ)飼料中添加0.08%的纖維素酶顯著提高了肉雞日增重。王鵬健等用含纖維素酶的復(fù)合酶制劑進(jìn)行羅非魚喂養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)試驗(yàn)組增重分別比對(duì)照組提高18.6%和15.1%。此外，有人發(fā)現(xiàn)纖維素酶對(duì)治療草食動(dòng)物胃腸疾病也有一定效果。陳俠甫等認(rèn)為，纖維素酶對(duì)馬急、慢性消化不良、便秘、牛前胃遲緩、瘤胃膨脹、瘤胃積食等疾病有明顯療效。
　　6 纖維素酶在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用存在的問題
　　6.1 添加量問題
　　雖然國內(nèi)外有關(guān)纖維素酶應(yīng)用的研究報(bào)道很多，但添加水平和結(jié)論并不一致。對(duì)于不同酶活性的產(chǎn)品、不同動(dòng)物種類、不同生理階段以及不同飼料品種的適宜添加量并沒有明確，因此在實(shí)際應(yīng)用中往往出現(xiàn)用量不當(dāng)而影響應(yīng)用效果。
　　6.2 單獨(dú)使用效果不明顯
　　植物細(xì)胞壁是一個(gè)極其復(fù)雜的體系，主要由纖維素搭成骨架，其中填充有大量半纖維素、果膠等物質(zhì)，還有不少的木質(zhì)素等，這些物質(zhì)相互交融混合構(gòu)成了極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體系，纖維素酶單獨(dú)使用難以將細(xì)胞壁徹底裂解，表現(xiàn)出效果不明顯。若搭配半纖維素酶、果膠酶等酶種使用則能取得較好效果。
　　6.3 纖維素酶對(duì)畜禽消化生理影響
　　飼喂纖維素酶后對(duì)于不同種類、不同發(fā)育階段動(dòng)物消化酶系的變化及纖維素酶添加后對(duì)內(nèi)源酶活力影響的研究不夠，這樣就難以合理地根據(jù)畜禽內(nèi)源酶狀況補(bǔ)充其他酶組成復(fù)合酶制劑應(yīng)用，以改變纖維素酶單獨(dú)使用效果不佳的狀況。
　　6.4 穩(wěn)定性問題
　　纖維素酶是一種微生物制劑，對(duì)溫度、濕度、酸、堿等敏感，處理不當(dāng)易失活，而對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定化處理的研究還不夠，也是導(dǎo)致飼用效果不穩(wěn)定的因素。
　　7 應(yīng)用前景
　　隨著人們對(duì)纖維素酶研究工作的深入，纖維素酶必將在食品、飼料、環(huán)境保護(hù)、能源和資源開發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮越來越大的作用。如何加大對(duì)纖維素酶研究和開發(fā)的科技投入，改變目前纖維素酶生產(chǎn)規(guī)模小、工藝設(shè)備落后，菌種產(chǎn)酶性能不佳、穩(wěn)定性差、生產(chǎn)成本高、技術(shù)水平低下的現(xiàn)狀，應(yīng)盡快采用各種高新技術(shù)，加大纖維素酶應(yīng)用研究工作的深度，這必將使纖維素酶得到更廣泛的應(yīng)用，從而極大地促進(jìn)我國畜牧業(yè)的發(fā)展。

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