兩大飼用淀粉酶制劑的研究進(jìn)展

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兩大飼用淀粉酶制劑的研究進(jìn)展

  
    中國飼料在線2006年8月10日報道:  基因工程技術(shù)在飼用酶制劑研究中的應(yīng)用已成為酶制劑研究與生產(chǎn)的主要手段。本文簡單介紹飼用酶制劑的應(yīng)用現(xiàn)狀、存在問題、重點(diǎn)對飼用蛋白酶與淀粉酶基因工程技術(shù)的研究進(jìn)展以及酶制劑的應(yīng)用前景等方面做了綜述，提出了一些觀點(diǎn)與看法。
    飼用酶制劑是指利用微生物技術(shù)生產(chǎn)的胞外酶，通常用作飼料添加劑，對于消除抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高資源利用率、開辟新的飼料來源以及解決畜牧業(yè)環(huán)境污染具有重要作用。近幾年，飼用酶制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用，研究十分活躍，應(yīng)用前景廣闊。

    目前，在酶的效力和投人產(chǎn)出比方面似乎仍有爭議。今后的研究，除注重酶在飼料中的應(yīng)用條件及依據(jù)特定飼料組分而設(shè)計酶制劑外，重點(diǎn)是改進(jìn)已生產(chǎn)的酶制劑的質(zhì)量和效能，借助DNA重組技術(shù)以微生物、植物種籽及動物自身來生產(chǎn)酶，建立評估各種酶產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)程序，及在預(yù)測酶對各種動物和各種飼料效果的模式等方面加大研究力度。特別是基因工程技術(shù)在飼用酶制劑研究中的應(yīng)用，已成為世界各國尤其是發(fā)達(dá)國家進(jìn)行酶制劑研究與生產(chǎn)的主要手段。

    基因工程技術(shù)在飼料用酶中的應(yīng)用主要包括兩個方面：（1）利用重組微生物反應(yīng)器高效表達(dá)目的酶，降低生產(chǎn)成本。（2）利用基因工程技術(shù)改良飼用酶制劑，提高酶的質(zhì)量與效率。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過將部分微生物的基因改造，例如，通過基因工程手段，將酶蛋白的基本結(jié)構(gòu)改變，強(qiáng)化酶在某方面的功能特性的這一做法已成為商業(yè)上成功的典范，然而，這種做法給酶制劑的應(yīng)用帶來安全的隱患。所以，對經(jīng)改造，尤其是經(jīng)過基因技術(shù)改造的酶制劑，必須經(jīng)過合理的、必要的安全評價才能工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。      

    蛋白酶研究進(jìn)展

    蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的酶類，是農(nóng)業(yè)上應(yīng)用最多的酶制劑之一。蛋白酶制劑的種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，等等。蛋白酶廣泛存在于人和動物的消化道中，在植物及微生物中含量豐富。由于動植物資源有限，農(nóng)業(yè)上用蛋白酶制劑主要通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)，所以飼用蛋白酶主要來源于微生物，生產(chǎn)蛋白酶的微生物種類很多，有細(xì)菌和真菌，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬（Penicillum），等等。

    在單胃動物飼料中添加蛋白酶主要有兩大作用，一是補(bǔ)充動物體內(nèi)源蛋白酶的不足。幼豬和幼禽消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，產(chǎn)酶不足，微生物活性較低，在飼料中添加蛋白酶就可以幫助幼齡動物對蛋白質(zhì)的消化。二是消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用。飼料中植物性成分，特別是豆類植物，廣泛存在蛋白酶抑制劑和凝集素，它們對飼料營養(yǎng)價值有很大影響，不過對家禽而言，還有待進(jìn)一步的研究。實(shí)驗(yàn)表明，許多微生物蛋白酶可以降解動物消化道中對蛋白酶有抑制作用的蛋白酶抑制劑和凝集素，消除它們的影響，減輕這些因子的抗?fàn)I養(yǎng)作用。

    反芻動物既能利用植物性蛋白也能利用動物性蛋白，大部分植物蛋白和全部的非蛋白氮被瘤胃中微生物分解，合成菌體蛋白，菌體蛋白被動物分泌的蛋白酶消化吸收。

    目前，通過基因突變來改良蛋白酶的熱穩(wěn)定性的研究已取得了許多進(jìn)展，Imanaka等提出一種通過定點(diǎn)突變增加蛋白酶熱穩(wěn)定性的策略，他比較了來源于Bacillusstearothermophilus耐熱蛋白酶和Bacillusthermoproteolyticus的更耐熱的蛋白酶的氨基酸序列及高級結(jié)構(gòu)，確定了可能進(jìn)一步提高Bacillusstearothermophilus耐熱性的氨基酸殘基，Gly144位于a-螺旋中，將它替換成Ala（M1突變）后預(yù)期能提高α-螺旋的疏水性和穩(wěn)定性，從而提高其耐熱性，反之，Thr66替換成Ser（M3突變）后則預(yù)期降低其耐熱性，試驗(yàn)結(jié)果完全證實(shí)了這一設(shè)想。Yamashita等利用從一種毛霉Mucorpusillus中得到的Asp蛋白酶MPR為材料，將Ala101用Thr替換，Asp替換Gly186，然后，將突變的基因在釀酒酵母Saccharomycescerevisiae中表達(dá)。結(jié)果表明，這兩種突變，特別是Gly186處的突變造成酶的耐熱性顯著下降，如果讓這兩個突變發(fā)生在同一個分子上，酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步下降。以上這些研究雖然還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，但一正一反兩個例子充分說明了利用這種方法提高飼料用酶的耐熱性在理論上的可行性。

    許多微生物產(chǎn)生的胞外酶都是糖基化酶，寡聚糖與酶以N-糖基化或O-糖基化形式共價連接，也有一些是以非共價形式連接能夠通過各種物理方法將其分離。對于這些與胞外蛋白酶連接的寡聚糖，一般認(rèn)為在分泌到細(xì)胞外的過程中可以保護(hù)酶受免疫蛋白酶水解及增強(qiáng)酶的可逆性，Tsujita從A.oryzea分離到一種酸性蛋白酶A1，A1又可以分離成兩個組分A1a和A1b，每一個組分的糖基化比例都是50%，試驗(yàn)表明糖基化的酶對50%檸檬酸的變性作用有抵抗能力。根據(jù)這一特點(diǎn)，通過選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)使酶的糖基化程度和類型改變，也可達(dá)到改善蛋白酶的性質(zhì)。

    淀粉酶研究進(jìn)展

    淀粉一般是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。主要用于飼料工業(yè)的淀粉酶有a-淀粉酶、支鏈淀粉酶、葡萄糖淀粉酶。支鏈淀粉酶的特點(diǎn)是，能專一性的切開支鏈淀粉和糖原等分支點(diǎn)的a1-6糖苷鍵，形成直鏈淀粉。所以將該酶與其他淀粉酶配合使用，可使淀粉完全糖化。微生物中產(chǎn)生支鏈淀粉酶的菌種非常廣泛，最早發(fā)現(xiàn)的是酵母菌，此外細(xì)菌如假單胞菌、芽孢桿菌、固氮菌以及某些放線菌。近年來支鏈淀粉酶作為淀粉酶中的一個新品種應(yīng)用于飼料工業(yè)和食品工業(yè)。目前飼料中的主要成分是玉米，其中支鏈淀粉難以利用，造成飼料的浪費(fèi)。如添加一定的支鏈淀粉酶，再在動物內(nèi)源和外源淀粉酶的作用下，就能很好的消化吸收，提高飼料利用率，降低成本。

    由于飼料加工過程中的高溫階段及飼料中淀粉酶的主要作用場所為動物呈酸性的胃腸道，因此使得飼料用淀粉酶的基因工程改良研究與其他飼料用酶制劑一樣主要集中在酶的耐熱性與酸穩(wěn)定性上。通過多年的努力，這一研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。

    從80年代起，許多淀粉酶的研究工作集中在酶熱失活的機(jī)理上。導(dǎo)致a-淀粉酶熱失活的原因主要有兩種。第一種是高溫使得蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生變化，分子的有序結(jié)構(gòu)變?yōu)殡s亂無章。在pH為5.0、6.0、8.0，當(dāng)溫度升高到90℃時，解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens中的α-淀粉酶會不可逆的失活，但當(dāng)pH8.0時，若淀粉存在，可抑制酶失活。第二種也是更主要的一種原因就是在高溫下，Glu或Asp殘基會發(fā)生脫酰胺作用從而導(dǎo)致酶活性喪失，如地芽孢桿菌中a-淀粉酶熱失活的原因主要就是Glu或Asp的脫酰胺作用。與中溫酶相比，高溫酶具有額外的由2~3個特定Lys殘基構(gòu)成的鹽橋。DNA重組技術(shù)為獲得熱穩(wěn)定的淀粉酶提供了新思路。如嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）a-淀粉酶分子中第88位和第253位氨基酸殘基被Lys和/或Arg取代，可提高酶在高溫下的半衰期。同樣，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶分子中的第88、253和385位氨基酸殘基被Lys或Arg取代，其熱穩(wěn)定性也有所提高。

    1999年，美國Mitchinson等人發(fā)表了一項(xiàng)專利，對a-淀粉酶的耐溫性和耐酸性進(jìn)行了改良。研究的目的基因來源于地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）NCIB8061的a-淀粉酶編碼基因。利用基因突變技術(shù)，他們改變了酶的性質(zhì)。突變主要包括三種：一種為188位Asn的定點(diǎn)突變；第二種為188位Asn及15位Met同時被其他氨基酸所替代；第三種突變不僅包括前兩種氨基酸替代，還有其他位點(diǎn)的氨基酸替代。目的基因經(jīng)過定點(diǎn)突變后被轉(zhuǎn)化入受體菌--枯草芽孢桿菌中。研究發(fā)現(xiàn)，受體菌分泌的重組a-淀粉酶與原菌株表達(dá)的a-淀粉酶有耐溫性、耐酸性和有效性方面都得到了改良。例如，M15T/N188S突變的a-淀粉酶的活性較原始酶分別提高了2.1倍（可溶性底物）和1.7倍（淀粉底物）。M15T/H133Y/N188S三點(diǎn)突變的a-淀粉酶比活性提高了2.8倍；與原始a-淀粉酶相比，M15T/N188S突變的a-淀粉酶在酸性條件下具有更高的酶活性，當(dāng)pH值下降到5.2時，原始酶已無活性，但突變a-淀粉酶仍然具有活性；突變酶降低了酶對Ca2+的依賴性等。突變a-淀粉酶這些性質(zhì)提高了a-淀粉酶在飼料中應(yīng)用的有效性，為飼料用淀粉酶的基因工程改良提供了新的思路。

    構(gòu)建雜合基因也是一種有效的改良淀粉酶性質(zhì)的方法，如Shibuya將來源于A.shirousamii的a-淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因雜合在一起，在釀酒酵母中表達(dá)出一個145kDa大的雙功能的融合蛋白，它同時具有a-淀粉酶活性和葡萄糖淀粉酶活性，大大提高了酶降解淀粉的有效性，但表達(dá)量僅有2.3mg/L。同年，Shibuya等將此雜合基因在米曲霉中表達(dá)，將表達(dá)量提高到500mg/L，比在釀酒酵母中的表達(dá)量提高了200倍。

    雖然通過基因工程對淀粉酶進(jìn)行改良的大部分工作還處于實(shí)驗(yàn)室階段，但其潛力已被科學(xué)家們所認(rèn)可。

    隨著人們生活水平的提高及環(huán)境意識的增強(qiáng)，飼用酶制劑以其不產(chǎn)生殘留、無抗藥性、不污染環(huán)境等優(yōu)勢將會進(jìn)一步被推廣應(yīng)用。飼用酶制劑既能提高飼料的消化率和利用率，提高禽畜及魚類的生產(chǎn)性能，又能減少禽畜排泄物中的氮、磷的排泄量，保護(hù)水體和土壤免受污染。當(dāng)然，飼用酶制劑在研究及生產(chǎn)中的普遍應(yīng)用還面臨著許多問題，我國政府也正積極通過禁止在飼料中使用抗生素、激素等方式來保障飼料和安全，維護(hù)生態(tài)平衡。但隨著生物技術(shù)特別是基因工程技術(shù)和生產(chǎn)技術(shù)的提高，都將逐步解決。因而飼用酶制劑作為高效、無毒副作用和環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑，在21世紀(jì)將有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

lilyyang

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