不同制粒溫度下植酸酶活性的變化及畜禽飼養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)研究

apple12151007 · 發(fā)表于 2010-10-22 13:53:06

　　不同制粒溫度下植酸酶活性的變化及畜禽飼養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)研究

　　李富偉湯海鷗汪勇

　　摘要：試驗(yàn)將含有制粒專(zhuān)用植酸酶制劑的日糧樣本在四種溫度條件下進(jìn)行制粒，制粒后的飼料應(yīng)用植酸酶國(guó)標(biāo)法進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果表明：制粒專(zhuān)用植酸酶在調(diào)制溫度70℃左右，蒸汽壓力不高的情況下酶活基本沒(méi)有喪失，酶活性能比較理想;當(dāng)制粒溫度達(dá)到了80℃以上時(shí)，酶活出現(xiàn)明顯的降低，但總體都能保持在500U/Kg以上，制粒用植酸酶仍具有較好的耐熱性能。經(jīng)過(guò)動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，肉雞和育肥豬飼養(yǎng)對(duì)照組和處理組之間的平均日增重和料肉比差異都不顯著(p>0.01)，這說(shuō)明在添加制粒專(zhuān)用植酸酶后，對(duì)磷酸氫鈣的量進(jìn)行調(diào)整并不會(huì)影響肉雞和育肥豬的生長(zhǎng)性能，且同樣能達(dá)到普通植酸酶在粉狀飼料中的應(yīng)用效果。
　　關(guān)鍵詞：制粒專(zhuān)用植酸酶;酶活;肉雞;育肥豬
　　Study on variations of Phytase Activity at Different Pelleting Temperature and Comparison Experiments on Pig and Poultry Feeding
　　Li Fuwei，Tang Haiou, Wang Yong
　　(Feed research institute of CAAS，Beijing Challenge Bio-technology Limited Company，Beijing，100081)
　　在日糧中添加植酸酶不僅可提高動(dòng)物對(duì)植酸磷的利用率，而且還能降低磷在糞便中的排出量。但植酸酶為了達(dá)到功效必須在到達(dá)胃腸道時(shí)具有生物活性。由于飼料制粒機(jī)中蒸汽的加入和通過(guò)壓模機(jī)處理時(shí)的摩擦，提高了飼料溫度，使植酸酶的結(jié)構(gòu)在熱的條件下易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性[1]。但是隨著對(duì)植酸酶應(yīng)用研究的不斷開(kāi)展，在提高植酸酶耐熱性方面的研究工作目前已經(jīng)得到長(zhǎng)足的發(fā)展，從最初用固相載體穩(wěn)定化處理酶發(fā)展到應(yīng)用穩(wěn)定劑結(jié)合包衣加工工藝，從基礎(chǔ)的菌種篩選到應(yīng)用分子生物學(xué)誘變，這些技術(shù)很大程度上消除了逆性因子對(duì)飼用酶的破壞作用，使植酸酶能保持較高活力在畜禽體內(nèi)發(fā)揮生物水解作用。本試驗(yàn)就挑戰(zhàn)制粒專(zhuān)用植酸酶的在制粒過(guò)程中的酶活變化情況和在肉雞及育肥豬中的飼養(yǎng)效果進(jìn)行研究，以便考察此酶的實(shí)際應(yīng)用效果。
　　1 材料與方法
　　1.1 植酸酶
　　采用北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司特節(jié)磷制粒專(zhuān)用植酸酶5000型，每克含植酸酶5000 U以上(樣品在底物濃度為5.0mmol/L、溫度37℃、pH值5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1mmol無(wú)機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以U表示)。
　　1.2 試驗(yàn)動(dòng)物
　　21日齡的艾維因肉雞;杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬。
　　1.3 試驗(yàn)方法
　　1.3.1 制粒試驗(yàn)
　　下表1是植酸酶添加到飼料時(shí)參數(shù)的設(shè)定，“條件一、二”設(shè)定對(duì)象是正常肉雞飼料，“條件三”是正常肉鴨飼料，“條件四”是正常育肥豬飼料。在設(shè)定的所有飼料制粒前加入挑戰(zhàn)特節(jié)磷制粒專(zhuān)用植酸酶120g，然后按照表1制粒條件進(jìn)行實(shí)際的顆粒飼料生產(chǎn)，最后隨機(jī)收集四種條件下顆粒飼料樣品，對(duì)其進(jìn)行植酸酶活性的檢測(cè)。
　　

　　1.3.2 飼養(yǎng)試驗(yàn)
　　1.3.2.1 肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)
　　選雞400只，按體重一致、公母各半原則隨機(jī)分為兩組，每組5重復(fù)，每重復(fù)40只。第一組為對(duì)照組，飼喂正常顆粒飼料，總磷含量為0.65%，第二組為處理組，按“條件二”情況進(jìn)行飼料制粒，在對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上減少氫鈣添加量0.7%，總磷含量為0.55%，添加石粉使鈣達(dá)到對(duì)照組水平，剩余空間用沸石粉補(bǔ)充，肉雞自由采食飲水，試驗(yàn)期21天，試驗(yàn)期間測(cè)定具體日增重和料肉比，結(jié)果應(yīng)用SPSS軟件分析。具體配方和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2：
　　

　　1.3.2.2 育肥豬飼養(yǎng)試驗(yàn)
　　選用體重27.00±1.00 kg 的杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬42頭，每頭豬戴耳標(biāo)，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組21頭豬，每組分3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組7頭豬。第一組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，總磷含量為0.65%，第二組為處理組，按“條件四”情況進(jìn)行飼料制粒，在對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上減少氫鈣添加量0.35%，總磷含量為0.56%，添加石粉使鈣達(dá)到對(duì)照組水平，剩余空間用沸石粉補(bǔ)充。試驗(yàn)共55d，其中預(yù)飼期23 d，試驗(yàn)期32 d。試驗(yàn)期間測(cè)定具體日增重和料肉比，結(jié)果應(yīng)用SPSS軟件分析。具體配方和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表3：
　　

　　1.4 植酸酶檢測(cè)方法
　　飼用植酸酶活性的測(cè)定——分光光度法(GB/T 18634—2002)[2]，每個(gè)試驗(yàn)因子都同時(shí)作兩個(gè)平行兩個(gè)分解，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　2 結(jié)果與分析
　　2.1 制粒試驗(yàn)結(jié)果
　　根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)制粒后飼料進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4：
　　

　　從試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以看出，在飼料中添加120克5000U/g的植酸酶，理論上顆粒中植酸酶含量應(yīng)該為600U/Kg。但從結(jié)果可以看出，在“條件一”的環(huán)模壓縮比、調(diào)制溫度和蒸汽壓力三項(xiàng)參數(shù)值都比較低情況下，添加植酸酶的飼料經(jīng)制粒后酶活卻達(dá)到了625±22 U/Kg，這比理論值還要高。分析其中原因可能有兩點(diǎn)：第一，為了確保產(chǎn)品的酶活含量在一些不理想的條件(如儲(chǔ)運(yùn)溫度比較高、保存時(shí)間有些長(zhǎng)等)下仍能達(dá)到標(biāo)記值，生產(chǎn)植酸酶產(chǎn)品時(shí)的出廠酶活要高于5000U/g;第二，植酸酶測(cè)定是一種比較精細(xì)的工作，且受外界因素干擾比較厲害，測(cè)定可能會(huì)出現(xiàn)略微偏高的現(xiàn)象;所以制粒后的測(cè)定值略高于理論值屬于正常情況。同時(shí)從“條件一”的測(cè)定結(jié)果也可以說(shuō)明，制粒專(zhuān)用植酸酶在調(diào)制溫度70℃左右，蒸汽壓力不高的情況下酶活基本沒(méi)有喪失，酶活性能比較理想。
　　對(duì)比“條件二、三、四”的測(cè)定結(jié)果，出現(xiàn)“條件三”的各項(xiàng)參數(shù)都比較高的情況下酶活值卻變大的情況，但與“條件二、四”測(cè)定值相對(duì)差值很小，理論分析其原因可能是由混合均勻度、試樣采集和酶活測(cè)定等誤差造成。三種條件下溫度都達(dá)到了80℃以上，蒸汽壓力都有所提高，而相對(duì)理論值酶活卻出現(xiàn)明顯的降低，但總體都能保持在500U/Kg以上，這也說(shuō)明在80℃左右的制粒條件下該植酸酶仍具有較好的耐熱性能。
　　2.2 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
　　2.2.1 肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
　　根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)定飼養(yǎng)肉雞具體日增重和料肉比結(jié)果如下表5：
　　

　　注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.01)，下同。
　　從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)照組和處理組之間的平均日增重和料肉比差異都不顯著。這說(shuō)明在顆粒料中添加制粒專(zhuān)用植酸酶后，對(duì)磷酸氫鈣的量進(jìn)行調(diào)整并不會(huì)影響肉雞的生長(zhǎng)性能，且同樣能達(dá)到普通植酸酶在粉狀飼料中的應(yīng)用效果。
　　2.2.2 育肥豬飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
　　根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)定飼養(yǎng)育肥豬具體日增重和料肉比結(jié)果如下表6：
　　

　　從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，育肥豬的飼養(yǎng)結(jié)果對(duì)照組和處理組之間的平均日增重和料肉比差異同樣都不顯著，這也說(shuō)明制粒專(zhuān)用植酸酶在育肥豬養(yǎng)殖上同樣具有很好的功效。
　　3 討論
　　3.1 制粒對(duì)植酸酶酶活性的影響
　　酶的化學(xué)本質(zhì)是在氨基酸順序排列成一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)二硫鍵、氫鍵、鹽鍵、疏水作用和靜電作用等化學(xué)力，再折迭成對(duì)活力發(fā)揮起關(guān)鍵作用的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，而酶的穩(wěn)定性就取決于酶是否以最小自由能的構(gòu)象存在。在制粒的過(guò)程中，植酸酶既要承受干熱處理，又要承受濕熱的處理，植酸酶不僅吸收熱量導(dǎo)致構(gòu)像發(fā)生變化，同時(shí)水分子和酶分子內(nèi)氫鍵相互作用的破壞，使得植酸酶的構(gòu)像更容易發(fā)生變化。但是，植酸酶作為生物催化劑在飼料工業(yè)上應(yīng)用，不僅僅需要具有酶解植酸磷的作用，還應(yīng)使植酸酶能達(dá)到工業(yè)制作對(duì)穩(wěn)定性的要求。
　　因此，科研工作者們想盡辦法從多方面研究提高植酸酶耐高溫性能的方法。首先，從植酸酶生產(chǎn)的菌種出發(fā)，通過(guò)從極端環(huán)境中分離純化新菌種和進(jìn)行人工改造菌種基因的方法獲得。香港大學(xué)的Tye AJ等(2002)從Bacillus subtilis 168和B.licheniformis中發(fā)現(xiàn)兩種新型熱穩(wěn)定性的植酸酶，即使在Ca2+濃度很低、pH值中性的條件下，95℃保溫10min后仍能恢復(fù)80%的初始酶活[9]。Luis Pasamonts等(1997)將煙熏曲霉的熱穩(wěn)定性植酸酶基因?qū)階sp.niger中，并在其中過(guò)量表達(dá)植酸酶，該植酸酶在100℃以下經(jīng)過(guò)20分鐘，活性喪失10%，在90℃下120分鐘，仍有20%活性[10]。Pasamontes L等(2002)將Asp.fungi植酸酶基因與載體連接后再進(jìn)行基因重組，結(jié)果得到的酶在90℃下處理80分鐘，活性仍保留40%[11]。Lutz Jermutus等(2000)利用A.niger的植酸酶基因，基于酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)原理在A.terreus的植酸酶表面進(jìn)行離子交互作和氫鍵搭橋?qū)崿F(xiàn)了分子酶定向進(jìn)化，提高了酶的耐熱性[12]。
　　其次，從生產(chǎn)方式出發(fā)，通過(guò)包被和添加穩(wěn)定劑的方式可以提高植酸酶的耐熱性能。蘇東海等(2004)考察了不同種類(lèi)的糖、鹽及濃度在干熱及濕熱的情況下對(duì)植酸酶殘存酶活的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到包埋顆粒，其包埋率為82.8%，包埋后水分活度大于0.35時(shí)，包被酶在干熱的情況下殘存酶活比原酶有較大的提高，殘存酶活提高8.7%，濕熱的情況下，殘存酶活提高58.3%，胃蛋白酶對(duì)其的損壞作用也明顯減小[3]。Ha等研究一種新的熱穩(wěn)定性的植酸酶部分或充分結(jié)合Ca2+時(shí)的晶體結(jié)構(gòu)，也發(fā)現(xiàn)Ca2+對(duì)于該酶的活力和熱穩(wěn)定性有重要作用。在Ca2+高親和力結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合兩個(gè)Ca2+，連接酶分子氨基酸序列上的遠(yuǎn)距環(huán)狀片段，該酶的熱穩(wěn)定性顯著提高(使熱變性溫度提高了30℃)[13]。
　　3.2 制粒植酸酶在動(dòng)物生長(zhǎng)上的應(yīng)用
　　目前，普通植酸酶產(chǎn)品經(jīng)過(guò)多年的推廣應(yīng)用，其在動(dòng)物非高溫制粒飼料上使用功效已經(jīng)得到了廣泛的證明[4,5,6]。而對(duì)于耐高溫植酸酶，如果在飼料制粒后仍能保持很好的活性，則其對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)功效同樣應(yīng)該會(huì)得到有效的發(fā)揮。從本研究可以初步證明，在添加耐高溫植酸酶產(chǎn)品的肉雞和育肥豬料經(jīng)制粒后進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，肉雞和育肥豬的生產(chǎn)性能未出現(xiàn)顯著變化。何丹林等(2006)研究表明，以作正對(duì)照的含磷酸氫鈣1.60%的高鈣磷飼糧、作負(fù)對(duì)照的不含磷酸氫鈣的低鈣磷飼糧和在負(fù)對(duì)照飼糧中添加耐高溫植酸酶而得的植酸酶飼糧等三種能量蛋白水平相同的飼糧，對(duì)2日齡粵黃雞開(kāi)展60d 的飼養(yǎng)試驗(yàn)和屠宰試驗(yàn)，結(jié)果表明三組雞的軟腿率、死亡率和屠宰指標(biāo)的差異均不顯著(P>0.05)，植酸酶組的生產(chǎn)性能與正對(duì)照的差異不顯著(P>0.05)，但顯著地高于負(fù)對(duì)照組的(P<0.05)，其中增重較負(fù)對(duì)照組的提高了11%[7]。目前，耐高溫植酸酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用已經(jīng)得到了的快速發(fā)展[8]。相信隨著廣大科研工作的努力研究，耐高溫植酸酶產(chǎn)品必將會(huì)得到廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
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