細(xì)菌對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性嗎？

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         抗生素大量不當(dāng)?shù)氖褂靡l(fā)了嚴(yán)重的人類和動(dòng)植物健康問題以及大量對各種抗菌素的耐藥菌株的出現(xiàn)，抗菌肽也會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株嗎？抗菌肽與抗生素有什么區(qū)別？

陽光綠茶008

抗菌肽的研究現(xiàn)狀與展望

韓文瑜 ，孫長江

吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062

［摘要］耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)致使現(xiàn)有抗菌藥物對細(xì)菌感染治療的療效低下或無效，形成的危害日益嚴(yán)重，迫切需要開發(fā)出新型的抗菌制劑。高效、低毒、廣譜的抗菌肽作為最有希望代替抗生素的新藥制劑倍受國內(nèi)外科研工作者的關(guān)注，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本文綜述了抗菌肽的生物學(xué)特性，生物學(xué)活性及其作用機(jī)制，抗菌肽的篩選策略，分析了影響抗菌肽應(yīng)用中存在的問題，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

［關(guān)鍵詞］抗菌肽；研究進(jìn)展；應(yīng)用前景

Research Progress on Antimicrobial Peptides and its Development Prospect

Han Wen-yu, Sun Chang-jiang

(College of Animal Science and Veterinary medicine, Jilin University, Changchun 130062; China)

Abstract: The emergence of antibiotic-resistant bacteria make the bad or invalid therapeutic effect of the currently used antibiotics used to combat bacterial infections, which severely harm the human and animal health, and every effort to develop novel antibacterial agents are in great needed. Antimicrobial peptides have emerged as effective broad-spectrum therapeutic agents with a promising substitute for antibiotic, and antimicrobial peptides have been a primary focus of new drug research worldwide. This paper deals with an overview of the types, bioactivities, antibacterial mechanisms, selection methods. The problems in applications of the antibacterial peptides and prospects for future researches are also mentioned.  

Key words:　 antimicrobial peptides; research progress; application prospect

當(dāng)前，細(xì)菌性感染和疾病呈上升趨勢，細(xì)菌耐藥性的形成是一個(gè)重要的原因。由耐藥性細(xì)菌，如耐藥性結(jié)核桿菌、大腸桿菌和被稱為“超級細(xì)菌”耐甲氧西林金葡菌( MRSA)等對人和動(dòng)物造成的危害日趨嚴(yán)重。如何克服細(xì)菌的耐藥性是當(dāng)前的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。科研工作者們正努力尋求新的抗菌策略，這些策略包括：合理應(yīng)用抗生素；改造現(xiàn)有抗生素或研發(fā)新的抗生素；微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用；噬菌體制劑研究與應(yīng)用；中草藥細(xì)菌耐藥抑制劑研究與應(yīng)用；抗菌肽研究與應(yīng)用等。其中抗菌肽研究與應(yīng)用是最有前景的一個(gè)領(lǐng)域。

1 抗菌肽的主要生物學(xué)特性

1.1抗菌肽的概念與來源分類

抗菌肽（Antibacterial peptide）又叫抗微生物肽（Antimicrobial peptide）、抗生素肽（Antibiotics peptide），是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細(xì)胞等活性作用的多肽。1974年，瑞典科學(xué)家G. Boman等人向眉紋天蠶蛾( Samia Cynthia )蛹注入大腸桿菌后，在血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的堿性多肽類物質(zhì)，隨后誘導(dǎo)惜古比天蠶( Hyalophra Cecropia )蛹也發(fā)現(xiàn)了類似的抗菌活性物質(zhì)[1, 2]。1981年，將這種具有抗菌活性的物質(zhì)被命名為cecropin[3]，這是人們第一次真正意義上發(fā)現(xiàn)抗菌肽。隨后，又在多種生物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抗菌肽，抗菌肽廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的生物中，是天然免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，被稱為“第二防御體系”。迄今為止，國內(nèi)外報(bào)道大約有2000 多種抗菌肽被鑒定、分離出來，以天然抗菌肽作模板進(jìn)行人工合成的模擬肽已達(dá)數(shù)千種。

1.1.1昆蟲抗菌肽昆蟲是種群最大的生物種類，抗菌肽的數(shù)量難以估量?，F(xiàn)在，僅在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和蜻蜓目等8個(gè)目的昆蟲中發(fā)現(xiàn)超過200多種昆蟲抗菌肽類物質(zhì)，僅從家蠶這一種昆蟲獲得了40個(gè)抗菌肽基因，已報(bào)道的天蠶素約有30余種。

1.1.2哺乳動(dòng)物抗菌肽 1989年，Lee等首次從豬小腸中分離到哺乳動(dòng)物抗菌肽Cecropin P1[4]。目前，從豬中分離出至少18種，綿羊中至少30種，牛中至少30種抗菌肽。人類機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的防御素屬于抗菌肽中的一個(gè)大家族，根據(jù)其氨基酸的空間結(jié)構(gòu)和分泌部位的差別又分為三大類：人α-防御素(humand α-defensin)、人β-防御素(human β-defensin，HβD)、人θ-防御素(human θ-defensin）[5]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人防御素達(dá)35種以上，其中非常重要的防御素有10種。

1.1.3兩棲動(dòng)物抗菌肽兩棲類動(dòng)物裸露的具多種功能，在皮膚的分泌物中存在的大量皮膚活性肽具有多樣的生物學(xué)活性，其中大多數(shù)多肽類物質(zhì)均具有一定的抗微生物活性，在進(jìn)化上是一類非常古老而有效的天然防御物質(zhì)，往往歸為抗菌肽[6, 7]。在非洲爪蟾中就有十多種抗菌肽，不僅在皮膚顆粒腺表達(dá)，也有存在于胃粘膜和小腸道細(xì)胞[8]。在非洲爪蟾皮膚中發(fā)現(xiàn)的小分子抗菌肽----爪蟾素Magainins是較早發(fā)現(xiàn)的兩棲動(dòng)物抗菌肽，具有很高的抗菌活性，此后相繼發(fā)現(xiàn)了多種蛙類抗菌肽。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已經(jīng)從無尾兩棲動(dòng)物8個(gè)屬約40多種兩棲類動(dòng)物的皮膚中提取出了數(shù)百種抗菌肽，APD數(shù)據(jù)庫中就收錄了其中的548種。大量研究發(fā)現(xiàn)蛙類抗菌肽具有協(xié)同效應(yīng)，但不同的蛙類抗菌肽很少具有同源性。

1.1.4魚類、軟體動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物來源的抗菌肽  1986年，從豹鰨（Pardachirus marmoratus）分離到一種含有35 個(gè)氨基酸殘基抗菌肽Pardaxin是最早從魚類分離得到的兩親性陽離子α螺旋結(jié)構(gòu)具有穿膜作用的多肽，該肽是離子型神經(jīng)毒素，由該肽衍生出了一系列具有比蜂毒素抗菌活性更強(qiáng)，溶血活性更低的抗菌活性肽[9, 10]。1998年，Park 等報(bào)道了鯰（Parasilurus asotus）受傷時(shí)上皮粘膜細(xì)胞層分泌一種19個(gè)氨基酸殘基的組蛋白H2A抗菌肽parasinⅠ，具有廣譜強(qiáng)抗菌活性，其抗菌活性是蛙皮素magainin 2的12-100倍[11]。目前，從魚類分離得到49種以上抗菌肽。

防御素是貽貝等海洋軟體動(dòng)物的重要抗微生物肽，迄今發(fā)現(xiàn)的貽貝防御素根據(jù)其初級結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和共有的半胱氨酸序列分為Defensin、mytilin 和myticin 3 種[12]。蝦經(jīng)細(xì)菌感染后可誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，其中含有多種抗菌肽基因[13]。自1997年Destoumieux等首次報(bào)道甲殼動(dòng)物抗菌肽氨基酸全序列以來[14]，從甲殼類動(dòng)物如對蝦血細(xì)胞中分離出多種抗菌肽。

1.1.5植物抗菌肽  植物中也存在一些結(jié)構(gòu)上與昆蟲、哺乳動(dòng)物防御素結(jié)構(gòu)相似的植物抗菌肽，稱為植物防御素。大多數(shù)植物抗菌肽對植物病原具有良好活性，部分植物抗菌肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌，真菌，酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞均有毒性。Thionins是最早從植物中分離的抗菌肽，新近的研究表明小麥Thionins具有很好的殺利什曼原蟲活性[15]。

1.1.6細(xì)菌抗菌肽細(xì)菌抗菌肽又稱細(xì)菌素（bacteriocin），包括陽離子肽和中性肽，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可分泌。細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有桿菌肽(Bacitracin)、短桿菌肽S(Gramicidin S)、多粘菌素E(Polymyxin E)和乳鏈菌肽(Nisin)4種類型。目前，APD數(shù)據(jù)庫中就收錄的細(xì)菌素有119種，其中乳酸鏈球菌肽nisin是由乳球菌產(chǎn)生的含3～4個(gè)氨基酸殘基的短肽，它是一種耐酸性物質(zhì)，即使在胃這樣低pH環(huán)境中穩(wěn)定性也很高，能抑制革蘭氏陽性菌如梭狀芽孢桿菌和李氏桿菌。Bacillus spp.產(chǎn)生的桿菌肽mersacidin對“超級耐藥菌”--耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）具有良好的抑制作用，通過腹腔給藥可以清除MRSA感染小鼠血液、肺、肝、腎、脾等臟器中的細(xì)菌，并且對小鼠各器官?zèng)]有造成明顯的損害[16]。

1.2抗菌肽的理化特性與結(jié)構(gòu)分類

抗菌肽一般具有以下理化特性：（1）一般由10～50 個(gè)氨基酸組成，分子量小，熱穩(wěn)定性好，免疫原性低；（2）富含疏水和堿性氨基酸殘基，所以大多數(shù)抗菌肽都帶正電荷且具有兩親性；（3）抗菌肽在較大的離子強(qiáng)度和較低或較高的pH值下仍可保持較強(qiáng)的活性；（4）部分抗菌肽還有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。

不同來源、不同結(jié)構(gòu)的抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的保守性，且N 端富含極性氨基酸，絕大多數(shù)抗菌肽的第二位氨基酸殘基是Trp，C 端通常酰胺化，分子中間富含Pro，這些特征對抗菌肽廣譜的殺菌活性的高低起著至關(guān)重要的作用，甚至直接影響抗菌肽的殺菌活性。

根據(jù)其化學(xué)組成，高級結(jié)構(gòu)以及其功能進(jìn)行分類可將抗菌肽分為5類: (1) α-螺旋結(jié)構(gòu)類，如天蠶素（Cecropins），蛙皮素（Magainins）等；(2)β-折疊型，該類抗菌肽是在分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵，動(dòng)物防御素多數(shù)屬此類結(jié)構(gòu)，如綠蠅防御素分子內(nèi)有6個(gè)半胱氨酸形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，肽鏈C末段是帶有擬β轉(zhuǎn)角的反向平行的β片層；(3) 伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類，該類抗菌肽不含半胱氨酸，但富含脯氨酸和精氨酸或色氨酸殘基，如從蜜蜂體內(nèi)分離到的apidaecins中脯氨酸和精氨酸的含量分別高達(dá)33% 和17 %，通常由15～34個(gè)氨基酸殘基組成在兩親性分子內(nèi)部形成分子內(nèi)α-螺旋； (4) 環(huán)鏈結(jié)構(gòu)類，該類抗菌肽在C末端有一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，在C末端形成一個(gè)環(huán)鏈結(jié)構(gòu)，而N末端為線狀結(jié)構(gòu)，如青蛙皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的brevinins和bactenecin均屬于此類；(5)由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽[1]。

2. 抗菌肽的生物活性及作用機(jī)制

2.1抗菌肽的抗細(xì)菌作用  在APD數(shù)據(jù)庫中有1158個(gè)抗細(xì)菌肽，至少有113種以上的不同細(xì)菌均能被抗菌肽所殺滅?？咕牡目咕饔脵C(jī)理的研究比較多。一是基于膜攻擊作用的殺菌機(jī)制有一下幾個(gè)模型[17, 18]：（1）桶板模型(barrel-stave model)：帶正電荷的含α-螺旋抗菌肽單體與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂分子相互吸引而結(jié)合在細(xì)胞膜表面，多個(gè)抗菌肽分子形成多聚體，擾亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排序，并以與膜表面垂直的排列方式將疏水基團(tuán)插到磷脂雙分子層，形成橫跨細(xì)胞膜的離子通道，造成細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)泄漏和電化學(xué)勢喪失，細(xì)胞膜崩解而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（2）地毯模型 (carpet model)：以該機(jī)制殺菌的抗菌肽并不插入細(xì)胞膜內(nèi)部，但在電荷作用下，一定濃度的抗菌肽像地毯樣展開平行排列在細(xì)胞膜表面或形成顆物，利用疏水作用和分子張力作用改變細(xì)胞膜的表面張力，從而在細(xì)胞膜上出現(xiàn)暫時(shí)的孔洞，除了細(xì)胞液的相互滲透，抗菌肽還可通過此孔洞進(jìn)入細(xì)胞。此外還有（3）穿孔螺旋模型（toroidal-hole model）：抗菌肽分子的極性端與磷脂分子的極性端相對一起形成以螺旋狀形式的連續(xù)翻轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致膜的完整性破壞和功能喪失；（4）分子團(tuán)聚集式(micellar aggregate)是抗菌肽分子以不規(guī)則形式聚集于膜表面，類似地毯式模型的作用形成跨膜電勢差而導(dǎo)致膜損傷。二是基于抗菌肽的非膜結(jié)構(gòu)破壞型機(jī)制，包括抗菌肽穿過細(xì)胞膜或核膜，作用于胞內(nèi)DNA、RNA，酶和蛋白質(zhì)等分子，可抑制細(xì)胞外膜蛋白質(zhì)，細(xì)胞壁的合成，抑制細(xì)胞的呼吸作用。如Carlsson等研究發(fā)現(xiàn)，attacin 能夠抑制大腸桿菌細(xì)胞外膜蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞的通透性增加，從而抑制細(xì)菌生長[19]。Fehlbaum 等用40µM 的昆蟲抗菌肽thanatin 處理大腸桿菌1 h 后細(xì)胞呼吸作用明顯變?nèi)酰幚? h 時(shí)后呼吸作用則完全停止，從而推斷thanatin 可能是通過抑制細(xì)胞的呼吸作用殺滅細(xì)菌。

2.2 抗菌肽的抗病毒作用目前在APD數(shù)據(jù)庫中有97個(gè)抗病毒肽，研究證明抗菌肽可以3種不同的機(jī)制起到抗病毒的作用：（1）可直接與病毒顆粒相互作用，如α-防御素等直接與對皰疹病毒粒子相結(jié)合而起作用；（2）干擾病毒的侵染過程，蜂毒素及其類似物K7I的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒衣殼蛋白的部分氨基酸序列存在相似性，以偽裝成病毒包被蛋白，干擾病毒的正常組裝；（3）抑制病毒的復(fù)制，蜂毒素和殺菌肽A可抑制HIV的復(fù)制。

2.3 抗菌肽對真菌的作用目前在APD數(shù)據(jù)庫中有97個(gè)抗真菌肽。來源于哺乳動(dòng)物的防御素對一些人類致病真菌具有殺傷作用；截取天蠶素A和蜂毒索分子的片段，合成雜合肽分子處理真菌孢子原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)不但真菌細(xì)胞壁無法恢復(fù)，而且細(xì)胞也被破壞，無法保持正常的細(xì)胞形態(tài)?？咕目拐婢淖饔脵C(jī)理包括：（1）阻止、破壞真菌細(xì)胞壁的合成，如棘球白素（echinocandins）是1,3-β-葡聚糖合成酶的抑制物，通過非競爭性抑制葡聚糖的合成而抑制真菌細(xì)胞生長；（2）與真菌細(xì)胞內(nèi)線粒體、核酸等大分子細(xì)胞器相互作用導(dǎo)致真菌死亡；（3）攻膜作用，在脂膜上形成孔洞，使重要的內(nèi)容物外泄。

2.4 抗菌肽的抗原蟲作用 部分抗菌肽可以有效地殺滅寄生于人類和動(dòng)物的寄生蟲。殺菌肽的類似物Shiva I在體外可以殺死惡性瘧原蟲[20]；殺菌肽／蜂毒素的雜合肽可以殺傷利什曼鞭毛蟲?？咕臍缂纳x時(shí)主要作用于寄生蟲細(xì)胞質(zhì)膜，損壞質(zhì)膜形態(tài)，迅速降低W／OH的通透性，破壞膜電勢。

2.5 抗菌肽的抑制腫瘤細(xì)胞作用目前在APD數(shù)據(jù)庫中還有95個(gè)抗腫瘤肽。腫瘤細(xì)胞對抗菌肽的敏感度比正常細(xì)胞要高，這可能與腫瘤細(xì)胞外膜含有較高的酸性磷脂成分有關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架系統(tǒng)不完善，也可能是易受抗菌肽作用的原因?？咕膶Π┘?xì)胞的作用主要是可以插入質(zhì)膜，使雙分子層發(fā)生融解、完整性被破壞，細(xì)胞膜上形成的孔洞使內(nèi)容物外泄，線粒體出現(xiàn)空泡化，嵴脫落，核膜破損，界限模糊不清，核染色體DNA斷裂，并抑制染色體DNA的合成。

抗菌肽的抗腫瘤作用的另外一個(gè)可能機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Mai等研究發(fā)現(xiàn)，將抗菌肽DP1局部注射到小鼠的體瘤內(nèi)，DP1 可以迅速誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是抗菌肽作用機(jī)制中的一種[21, 22]?？咕脑隗w內(nèi)還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.6 抗菌肽具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)血管生成功能  LL-37在體內(nèi)和體外均可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。LL-37可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，活化基質(zhì)蛋白酶，促有絲分裂蛋白酶，激活磷酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終反式激活內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)表皮細(xì)胞再生或形成肉芽組織愈合傷口[23]。在體內(nèi)LL-37以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KGF）等多種細(xì)胞生長因子表達(dá)，刺激腸上皮細(xì)胞生長，保證腸上皮組織屏障的完整性[24]。本室從牛蛙皮膚中分離得到2種具有抗菌活性的多肽，同時(shí)檢測到其具有對細(xì)菌感染創(chuàng)面促進(jìn)創(chuàng)傷愈合作用。

2.7 抗菌肽的中和、阻斷內(nèi)毒素的作用  來自人的抗菌肽hCAP18 具有通過結(jié)合并中和、阻斷內(nèi)毒素的作用，10 mg和100 mg hCAP18 均能夠顯著抑制由LPS誘導(dǎo)增加的炎性細(xì)胞數(shù)，降低NO，TNF-α，PGE2, MCP-1和MIP-2水平[25, 26]。

2.8 抗菌肽的白細(xì)胞趨化與免疫激活作用 感染或損傷處所分泌的Cathelicidins和defensins 對效應(yīng)細(xì)胞具有趨化性, 誘導(dǎo)化學(xué)激活素的轉(zhuǎn)錄及分泌和肥大細(xì)胞的組胺釋放, 這些反應(yīng)一起則能促進(jìn)先天的及獲得性免疫細(xì)胞的補(bǔ)充。LL-37是只存在于人腸道的屬于 cathelicidin家族的抗菌肽，具有直接的殺菌活性。LL-37作用宿主Toll樣受體， 加強(qiáng)TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄和增加TLR4，引發(fā)宿主主細(xì)胞（mast cell）釋放 IL-4，IL-5，IL-1β，激活宿主的先天性免疫[27]。

2.9 抗菌肽的炎性及免疫抑制作用  LL-37通過多種作用協(xié)同炎癥因子IL-1β等細(xì)胞因子的釋放[27, 28]。哺乳動(dòng)物抗菌肽除了具有促炎性反應(yīng)外, 也能阻止有害的炎癥應(yīng)答。Cathelicidin家族的抗菌肽能夠抑制致炎細(xì)胞因子如TNF-α，IFN-r和IL-6的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、促炎癥反應(yīng)物質(zhì)的釋放及避免細(xì)菌感染后嚙齒類的膿毒癥, 還能防止引起阻止損傷和炎癥的毒性組分的產(chǎn)生[29-31]，研究表明Cathelicidin家族抗菌肽還可通過調(diào)節(jié)TLR4來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[32]。

2.10 免疫調(diào)節(jié)作用抗菌肽可以通過對靶細(xì)胞的凋亡、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其它抗原遞呈細(xì)胞趨化性的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞因子的產(chǎn)生和B細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答而作用于先天及獲得性免疫[17, 33]。

3 抗菌肽篩選策略

3.1基于分離技術(shù)的篩選策略以各種蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)從組織中直接分離純化是將宿主經(jīng)誘導(dǎo)后取特定組織制成組織勻漿，經(jīng)超速離心、Sephadex -G50層析、反相高效液相色譜或電泳分離等各種蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)可以得到不同樣品，用MALDI-TOF質(zhì)譜對樣品進(jìn)行分析和活性測定。從組織中直接分離純化不足之處在于天然含量極微，提取步驟煩瑣、得率低[34]。

3.2 利用差異顯示技術(shù)篩選抗菌肽編碼基因利用差異顯示技術(shù)對進(jìn)行誘導(dǎo)和未進(jìn)行誘導(dǎo)基因的差異表達(dá)進(jìn)行研究，可得到一些新的抗菌肽類相關(guān)基因，這是關(guān)于基因分離、表達(dá)研究的較新的方法。Kim等就利用差異顯示技術(shù)分離到了一種新抗菌肽Enbocin。

3.3 基于同源序列篩選抗菌肽編碼基因以細(xì)菌誘導(dǎo)動(dòng)物體產(chǎn)生抗菌肽或直接取特定組織提取mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，根據(jù)已知抗菌肽的DNA序列設(shè)計(jì)保守的PCR引物或制備寡核苷酸探針，可以在文庫中篩選具有序列同源性的編碼基因，這種策略的應(yīng)用加速了不同物種間同源抗菌肽的發(fā)現(xiàn)對庫進(jìn)行測序篩選，用該法可以得到分離純化方法得不到的抗菌活性的多肽[35]。本室以上述方法從牛蛙皮膚獲得了牛蛙皮膚組織抗菌肽粗提物對枯草桿菌、李氏桿菌、綠膿桿菌、李斯特菌、金葡菌有較好的抑菌活性，并結(jié)合cDNA文庫篩選策略獲得多個(gè)具有抗菌活性的多肽。

3.4 用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)和鑒別抗菌肽 生物信息學(xué)研究已經(jīng)在擬南芥 、人、鼠、雞等多種模式生物中成功地篩選到了新的抗菌肽或β-防御素基因。生物信息學(xué)方法可以用來設(shè)計(jì)具有特定功能的氨基酸序列，也可以進(jìn)行抗菌肽的設(shè)計(jì)?？咕臄?shù)據(jù)庫APD ( http://aps.unmc.edu/AP/main.php) 的建立為用生物信息學(xué)研究抗菌肽提供了支持，目前在該數(shù)據(jù)庫中有約2000余種抗菌肽，該數(shù)據(jù)庫具有根據(jù)抗菌肽家族（如細(xì)菌素、防御素等），多肽來源（如魚類、蛙類），翻譯后修飾（如酰胺化，氧化，糖基化等），多肽靶向位點(diǎn)（如膜靶向，蛋白靶向，脂多糖靶向等）檢索功能，不同來源抗菌肽的氨基酸殘基特性分析和數(shù)據(jù)庫輔助的多肽設(shè)計(jì)。Wang等通過該數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)出了抗大腸桿菌活性高于人源抗菌肽LL-37的抗菌肽GLK-19[36]。

3.5 其他高通量篩選鑒別抗菌肽的策略 Loit等將表達(dá)文庫菌涂在膜支持物上，誘導(dǎo)后挑出陽性克隆測抑菌活性可以快速從表達(dá)文庫中高通量地篩選抗菌肽[37]。篩選合成肽庫或噬菌體展示肽庫也是較好的抗菌肽高通量篩選的策略，通過此策略可能得到一系列序列相關(guān)的具有抗菌活性的化合物，并可以研究結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系[38, 39]。Rathinakumar等以穿透人工合成的脂膜為指標(biāo)，從16384個(gè)短肽庫中篩得10個(gè)多肽，雖然它們在基序、長度和電荷等特性方面存在較大差異，但具有同穿透性抗菌肽一樣的活性，以些方法篩得到了抗菌活性不依賴于特定基序和三級結(jié)構(gòu)的膜結(jié)活性（interfacial activity）的抗菌多肽[2, 40]，Cherkasov等利用人工智能網(wǎng)絡(luò)技術(shù)也引入到了抗菌肽的篩選，并篩得到了比常規(guī)方法篩到的抗菌肽抗超級耐藥菌活性更高的多肽化合物[41]。

3.6 抗菌肽的分子設(shè)計(jì)伴隨每一種新抗菌肽的發(fā)現(xiàn)，都會(huì)進(jìn)行氨基酸序列的修飾，目的是尋找對抗菌活性影響的關(guān)鍵部位，并進(jìn)一步進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。對天然抗菌肽進(jìn)行序列修飾包括以下內(nèi)容，即增加、刪除、或替代1個(gè)或多個(gè)殘基，截取肽鏈N端或C端部分序列，連接不同自然來源的抗菌肽片段成為雜合肽等。蛙皮膚抗菌肽ascaphin-8和 XT-7具有廣譜的抗菌活性，但因?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞有毒性作用而不能用于臨床，通過將ascaphin-8 的Ala(10), Val(14)和 Leu(18)殘基替換為L-Lys 或 D-Lys，將XT-7的Gly(4) 替換為L-Lys，增加了抗菌肽分子兩親性，減少了螺旋數(shù)和疏水性，保持了原有抗菌活性并且降低了毒性[42]。Ahmad等以研究了牛抗菌肽BMAP-28的N- 和 C-末端鋅指結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，用丙氨酸殘基替換亮氨酸或異亮氨酸殘基，設(shè)計(jì)出了具有細(xì)胞選擇性的七價(jià)重復(fù)序列的BMAP-28類似物，具有更低的毒性作用[43]，而Jenssen等利用可以計(jì)算相鄰氨酸殘基間能量的兩個(gè)數(shù)學(xué)模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測出測試多肽或生物活性[44, 45]。

4 抗菌肽的應(yīng)用前景

4.1抗菌肽作為新型抗生藥物，在疾病治療與預(yù)防中具有廣闊的應(yīng)用前景?？咕氖且环N很有潛力的新抗菌藥物來源，是一個(gè)方興未艾的領(lǐng)域，隨著研究的不斷深入，會(huì)有一大批新型抗菌肽被發(fā)現(xiàn)，可望成為新型的抗菌和抗腫瘤藥物在臨床上應(yīng)用，具有廣譜抗菌且有獨(dú)特的抗菌機(jī)制的抗菌肽顯然在克服細(xì)菌耐藥性方面具明顯優(yōu)勢。目前已有十余種抗菌肽進(jìn)行臨床前或臨床研究，隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、抗菌肽作用機(jī)制及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化，設(shè)計(jì)一種高效的、有利于人類健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。

4.2 抗菌肽可能成為一種新型的藥物載體。兩親性抗菌肽的膜穿透性是其作為藥物運(yùn)輸載體的基礎(chǔ)，Laszlo Otvos等將分子量小且富含精氨酸殘基的昆蟲抗菌肽pyrrochoricin和其衍生物作為施藥運(yùn)載工具，可將抗原性較弱的9個(gè)殘基的MHC-1的抗原表位遞送到小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，證實(shí)pyrrochoricin 同系物具有運(yùn)載抗原依賴性疫苗的潛力[46]。Magainin 與溶于50%乙醇的表面活性劑增強(qiáng)劑N-月桂酰肌氨酸一起可以破壞皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而增加了藥物的皮膚透過性，該結(jié)果顯示出抗菌肽作為透皮給藥載體具有很好的發(fā)展前景[47-49]，進(jìn)一步探討抗菌肽作為穿膜肽的應(yīng)用具有廣闊的前景。

4.3抗菌肽類食品防腐劑。天然防腐劑的研究和開發(fā)利用成了食品工業(yè)的一個(gè)熱點(diǎn)。由于抗菌肽類防腐劑所具有的安全無毒害，甚至對人體有一定營養(yǎng)保健作用等優(yōu)點(diǎn)，其研究開發(fā)無疑是一個(gè)很有前途的重要課題。乳酸鏈球菌素(Nisin)能夠抑制部分革蘭氏陽性菌的生長，尤其是可形成芽孢的細(xì)菌，Nisin 能阻止梭菌的生長與毒素形成，抗菌效果更強(qiáng)。Nisin 的應(yīng)用與其它防腐劑相比，具有用量少、使用方便、防腐效果好、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，使用它還可降低殺菌溫度，減少熱處理時(shí)間，因此能改進(jìn)食品營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、顏色等性狀。

4.4 抗菌肽作為畜禽飼料添加劑在畜牧業(yè)的應(yīng)用?？股靥砑觿┑氖褂脟?yán)重破壞了動(dòng)物腸道的微生物平衡，并易在動(dòng)物體內(nèi)殘留，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)和人類的健康。用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型抗菌肽添加劑或者通過日糧因素調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)而達(dá)到畜產(chǎn)品無抗生素化值得進(jìn)一步研究。本室以中國鱟抗菌肽tachyplesins I 、polyphemusins 、乳酸菌素Gassericin T 、中國林蛙皮膚抗菌肽RC基因酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)物制備的抗菌肽制劑肽百康在雞飼糧中的添加量達(dá)500g/t時(shí)，不但能有效地抑制飼料中細(xì)菌的繁殖，顯著增加雞的平均日增重，提高對雛雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)，作用最為明顯。

4.5 抗菌肽在畜禽疾病治療與預(yù)防中的應(yīng)用。柞蠶抗菌肽應(yīng)用于預(yù)防及治療雞白痢效果明顯。陳曉生等報(bào)道，飼料中添加抗菌肽對肉鴨有促進(jìn)生長的作用，應(yīng)用含抗菌肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬料，飼喂試驗(yàn)結(jié)果表明可減輕斷奶仔豬腹瀉。Wang等研究表明飼喂豬腸抗菌肽SGAMP能增強(qiáng)SPF雞的粘膜免疫[50]。本室研制的抗菌肽制劑肽百康作為豬飼料添加劑可提高仔豬的日增重同時(shí)具用預(yù)防腹瀉的作用，尤以基礎(chǔ)日糧中添加320g/噸肽百康效果最好，應(yīng)用于斷奶應(yīng)激期間的仔豬抗腹瀉取得了與抗生素預(yù)防相同的作用效果。

4.6 抗菌肽作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用。水產(chǎn)養(yǎng)殖中在餌料中大量使用抗生素作為添加劑, 不僅破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群, 而且易在動(dòng)物體內(nèi)殘留?；蚬こ炭咕奶娲鷤鹘y(tǒng)抗生素或作為環(huán)保型餌料添加劑，既可以增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的抗病能力, 又可以提高養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量。

4.7 轉(zhuǎn)抗菌肽基因動(dòng)物氣管黏膜抗菌肽在小鼠乳腺組織表達(dá)，重組肽對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌以及白色念珠菌均具有抗菌活性。近年來，將對病原生物有抑制作用的抗菌肽基因?qū)雮鞑ソ轶w(蚊) 中,使其在昆蟲體內(nèi)高效穩(wěn)定的表達(dá)，從而切斷病原物的傳播途徑。

4.8 轉(zhuǎn)抗菌肽基因植物培育抗病新品種是防治植物病害的根本途徑。業(yè)已完培育成功的抗病轉(zhuǎn)抗菌肽基因植物有抗梨火疫病轉(zhuǎn)基因蘋果樹，抗煙草野火病、煙草花葉病毒病的轉(zhuǎn)基因煙草，抗水稻白葉枯病轉(zhuǎn)基因水稻，抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草等[51]，將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物是培育作物抗病新品種的有效策略。

5 抗菌肽研究存在的問題

目前，研發(fā)綠色、新型、高效、低毒、廣譜的抗菌制劑已成為全球的熱潮。新型抗菌肽不斷被發(fā)現(xiàn)，天然抗菌肽的人工修飾最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。

雖然抗菌肽的研究時(shí)間不長，大量研究結(jié)果預(yù)示，抗菌肽的應(yīng)用將帶來生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一場“綠色革命”，但magainin，indolicidin，protegrin等體外抗菌活性較好的抗菌肽已進(jìn)入臨床超過10年，還存在抗菌活性較弱，非特異性毒性作用和對蛋白酶敏感等問題而限制其應(yīng)用[52]。真正將抗菌肽推向市場，應(yīng)用于臨床可能還要面臨很多挑戰(zhàn)，還必須繼續(xù)深入研究以下幾個(gè)問題。

5.1 抗菌肽的來源問題在動(dòng)物體內(nèi)天然含量極微，天然資源有限；其次，抗菌肽分子量小，分離純化困難，提取步驟煩瑣、得率低；再次，抗菌肽化學(xué)合成成本高，價(jià)格昂貴。如何提高抗菌肽的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本的難題成為目前抗菌肽研究與應(yīng)用的瓶頸。

5.2抗菌肽的活性問題雖然基因工程抗菌肽在一級結(jié)構(gòu)上與天然抗菌肽一致，卻無法保證空間結(jié)構(gòu)上的一致而造成活性差異。另外，天然防腐劑的抗菌譜較窄，客觀上使其應(yīng)用領(lǐng)域受到了限制。

5.3抗菌肽的毒性問題至今尚無資料表明抗菌肽的體內(nèi)毒性問題。但抗菌肽可能會(huì)引起過敏反應(yīng)，僅用于局部治療；許多天然抗菌肽都有溶血性。

5.4 抗菌肽的功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系問題 目前，天然來源的抗菌肽已不能滿足進(jìn)一步對其作用機(jī)理及其高級結(jié)構(gòu)研究的需要。

5.5 抗菌肽的體內(nèi)穩(wěn)定性問題抗菌肽一級結(jié)構(gòu)中由于含有多個(gè)堿性氨基酸殘基(如賴氨酸、精氨酸)而容易被胰蛋白酶水解，從而限制了抗菌肽作為抗感染藥物的體內(nèi)使用。開發(fā)同時(shí)具有抗菌活性與胰蛋白酶抑制劑活性的雙功能多肽，為解決抗菌肽作為藥物的體內(nèi)使用遇到的蛋白酶水解問題提供了新的方法。

5.6 抗菌肽的耐藥性問題由于抗菌肽或者細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)因子觸發(fā)病原體產(chǎn)生的一種耐藥性機(jī)制，這種機(jī)制包括：微生物對抗菌肽的應(yīng)激協(xié)同反應(yīng)，蛋白酶介導(dǎo)的耐藥性，細(xì)胞內(nèi)外靶位的修飾和抗菌肽的外排作用等[53]。例如：Perron等在實(shí)驗(yàn)室中對E. coli和 P. fluorescens 進(jìn)行持續(xù)600~700 代的篩選，22/24譜系獨(dú)立進(jìn)化出了可遺傳的對陽離子抗菌肽exiganan 的耐藥性[54]。金黃色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解抗菌肽產(chǎn)生耐藥性外[55]，還可以通調(diào)節(jié)vraDE和vraSR 改變膜的轉(zhuǎn)運(yùn)作用而產(chǎn)生對蛙類抗菌肽temporin L和dermaseptin K4-S4的耐藥性[56]。

5.7 抗菌肽在生命體防御系統(tǒng)中準(zhǔn)確地位以及模式生物研究抗菌肽表達(dá)水平與各種疾病具有相關(guān)性?？咕?、防御素與消化系統(tǒng)疾病如幽門螺桿菌感染、炎癥性腸病、消化道腫瘤的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，但缺少用于研究的生物模型而制約研究的發(fā)展。

5.8 抗菌肽的基因工程表達(dá)存在的問題基因工程表達(dá)抗菌肽存在的問題主要有：抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，缺乏檢測抗菌肽方法?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物可能對宿主有害。目的基因在宿主基因組中的隨機(jī)整合有可能造成宿主染色體突變，同時(shí)也可能影響其他基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)抗菌肽基因動(dòng)植物陽性率偏低及其最終應(yīng)用時(shí)的安全性還有待研究等。

尋找有效的抗生素的道路困難重重，開發(fā)出一種新的抗生素需要耗時(shí)日久。在抗生素耐藥性日益嚴(yán)重、病毒病和腫瘤仍未攻克的今天，抗菌肽的出現(xiàn)無疑為人們尋找理想的抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物提供了新的領(lǐng)域，抗菌肽的應(yīng)用將給解決細(xì)菌抗藥性、藥物殘留等關(guān)鍵問題帶來希望。新型、高效、低毒、廣譜的抗菌肽將會(huì)在農(nóng)業(yè)、食品、衛(wèi)生用品、醫(yī)藥、化妝品、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動(dòng)植物抗病基因工程等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用，為人類創(chuàng)造巨大的價(jià)值。

（本文由作者根據(jù)第二屆中國獸藥大會(huì)“學(xué)術(shù)論壇”韓文瑜教授演講稿整理而成）