細菌對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性嗎？

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         抗生素大量不當?shù)氖褂靡l(fā)了嚴重的人類和動植物健康問題以及大量對各種抗菌素的耐藥菌株的出現(xiàn)，抗菌肽也會產(chǎn)生耐藥菌株嗎？抗菌肽與抗生素有什么區(qū)別？

陽光綠茶008

抗菌肽的研究現(xiàn)狀與展望

韓文瑜 ，孫長江

吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，長春 130062

［摘要］耐藥性細菌的出現(xiàn)致使現(xiàn)有抗菌藥物對細菌感染治療的療效低下或無效，形成的危害日益嚴重，迫切需要開發(fā)出新型的抗菌制劑。高效、低毒、廣譜的抗菌肽作為最有希望代替抗生素的新藥制劑倍受國內(nèi)外科研工作者的關注，成為當前的研究熱點。本文綜述了抗菌肽的生物學特性，生物學活性及其作用機制，抗菌肽的篩選策略，分析了影響抗菌肽應用中存在的問題，并對其應用前景進行了展望。

［關鍵詞］抗菌肽；研究進展；應用前景

Research Progress on Antimicrobial Peptides and its Development Prospect

Han Wen-yu, Sun Chang-jiang

(College of Animal Science and Veterinary medicine, Jilin University, Changchun 130062; China)

Abstract: The emergence of antibiotic-resistant bacteria make the bad or invalid therapeutic effect of the currently used antibiotics used to combat bacterial infections, which severely harm the human and animal health, and every effort to develop novel antibacterial agents are in great needed. Antimicrobial peptides have emerged as effective broad-spectrum therapeutic agents with a promising substitute for antibiotic, and antimicrobial peptides have been a primary focus of new drug research worldwide. This paper deals with an overview of the types, bioactivities, antibacterial mechanisms, selection methods. The problems in applications of the antibacterial peptides and prospects for future researches are also mentioned.  

Key words:　 antimicrobial peptides; research progress; application prospect

當前，細菌性感染和疾病呈上升趨勢，細菌耐藥性的形成是一個重要的原因。由耐藥性細菌，如耐藥性結(jié)核桿菌、大腸桿菌和被稱為“超級細菌”耐甲氧西林金葡菌( MRSA)等對人和動物造成的危害日趨嚴重。如何克服細菌的耐藥性是當前的研究重點和熱點?？蒲泄ぷ髡邆冋で笮碌目咕呗裕@些策略包括：合理應用抗生素；改造現(xiàn)有抗生素或研發(fā)新的抗生素；微生態(tài)制劑的研究與應用；噬菌體制劑研究與應用；中草藥細菌耐藥抑制劑研究與應用；抗菌肽研究與應用等。其中抗菌肽研究與應用是最有前景的一個領域。

1 抗菌肽的主要生物學特性

1.1抗菌肽的概念與來源分類

抗菌肽（Antibacterial peptide）又叫抗微生物肽（Antimicrobial peptide）、抗生素肽（Antibiotics peptide），是由多種生物細胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細胞等活性作用的多肽。1974年，瑞典科學家G. Boman等人向眉紋天蠶蛾( Samia Cynthia )蛹注入大腸桿菌后，在血淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的堿性多肽類物質(zhì)，隨后誘導惜古比天蠶( Hyalophra Cecropia )蛹也發(fā)現(xiàn)了類似的抗菌活性物質(zhì)[1, 2]。1981年，將這種具有抗菌活性的物質(zhì)被命名為cecropin[3]，這是人們第一次真正意義上發(fā)現(xiàn)抗菌肽。隨后，又在多種生物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抗菌肽，抗菌肽廣泛存在于從細菌到哺乳動物的生物中，是天然免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，被稱為“第二防御體系”。迄今為止，國內(nèi)外報道大約有2000 多種抗菌肽被鑒定、分離出來，以天然抗菌肽作模板進行人工合成的模擬肽已達數(shù)千種。

1.1.1昆蟲抗菌肽昆蟲是種群最大的生物種類，抗菌肽的數(shù)量難以估量?，F(xiàn)在，僅在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和蜻蜓目等8個目的昆蟲中發(fā)現(xiàn)超過200多種昆蟲抗菌肽類物質(zhì)，僅從家蠶這一種昆蟲獲得了40個抗菌肽基因，已報道的天蠶素約有30余種。

1.1.2哺乳動物抗菌肽 1989年，Lee等首次從豬小腸中分離到哺乳動物抗菌肽Cecropin P1[4]。目前，從豬中分離出至少18種，綿羊中至少30種，牛中至少30種抗菌肽。人類機體中發(fā)現(xiàn)的防御素屬于抗菌肽中的一個大家族，根據(jù)其氨基酸的空間結(jié)構(gòu)和分泌部位的差別又分為三大類：人α-防御素(humand α-defensin)、人β-防御素(human β-defensin，HβD)、人θ-防御素(human θ-defensin）[5]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人防御素達35種以上，其中非常重要的防御素有10種。

1.1.3兩棲動物抗菌肽兩棲類動物裸露的具多種功能，在皮膚的分泌物中存在的大量皮膚活性肽具有多樣的生物學活性，其中大多數(shù)多肽類物質(zhì)均具有一定的抗微生物活性，在進化上是一類非常古老而有效的天然防御物質(zhì)，往往歸為抗菌肽[6, 7]。在非洲爪蟾中就有十多種抗菌肽，不僅在皮膚顆粒腺表達，也有存在于胃粘膜和小腸道細胞[8]。在非洲爪蟾皮膚中發(fā)現(xiàn)的小分子抗菌肽----爪蟾素Magainins是較早發(fā)現(xiàn)的兩棲動物抗菌肽，具有很高的抗菌活性，此后相繼發(fā)現(xiàn)了多種蛙類抗菌肽。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已經(jīng)從無尾兩棲動物8個屬約40多種兩棲類動物的皮膚中提取出了數(shù)百種抗菌肽，APD數(shù)據(jù)庫中就收錄了其中的548種。大量研究發(fā)現(xiàn)蛙類抗菌肽具有協(xié)同效應，但不同的蛙類抗菌肽很少具有同源性。

1.1.4魚類、軟體動物、甲殼類動物來源的抗菌肽  1986年，從豹鰨（Pardachirus marmoratus）分離到一種含有35 個氨基酸殘基抗菌肽Pardaxin是最早從魚類分離得到的兩親性陽離子α螺旋結(jié)構(gòu)具有穿膜作用的多肽，該肽是離子型神經(jīng)毒素，由該肽衍生出了一系列具有比蜂毒素抗菌活性更強，溶血活性更低的抗菌活性肽[9, 10]。1998年，Park 等報道了鯰（Parasilurus asotus）受傷時上皮粘膜細胞層分泌一種19個氨基酸殘基的組蛋白H2A抗菌肽parasinⅠ，具有廣譜強抗菌活性，其抗菌活性是蛙皮素magainin 2的12-100倍[11]。目前，從魚類分離得到49種以上抗菌肽。

防御素是貽貝等海洋軟體動物的重要抗微生物肽，迄今發(fā)現(xiàn)的貽貝防御素根據(jù)其初級結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和共有的半胱氨酸序列分為Defensin、mytilin 和myticin 3 種[12]。蝦經(jīng)細菌感染后可誘導多種基因表達，其中含有多種抗菌肽基因[13]。自1997年Destoumieux等首次報道甲殼動物抗菌肽氨基酸全序列以來[14]，從甲殼類動物如對蝦血細胞中分離出多種抗菌肽。

1.1.5植物抗菌肽  植物中也存在一些結(jié)構(gòu)上與昆蟲、哺乳動物防御素結(jié)構(gòu)相似的植物抗菌肽，稱為植物防御素。大多數(shù)植物抗菌肽對植物病原具有良好活性，部分植物抗菌肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌，真菌，酵母及哺乳動物細胞均有毒性。Thionins是最早從植物中分離的抗菌肽，新近的研究表明小麥Thionins具有很好的殺利什曼原蟲活性[15]。

1.1.6細菌抗菌肽細菌抗菌肽又稱細菌素（bacteriocin），包括陽離子肽和中性肽，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可分泌。細菌中已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有桿菌肽(Bacitracin)、短桿菌肽S(Gramicidin S)、多粘菌素E(Polymyxin E)和乳鏈菌肽(Nisin)4種類型。目前，APD數(shù)據(jù)庫中就收錄的細菌素有119種，其中乳酸鏈球菌肽nisin是由乳球菌產(chǎn)生的含3～4個氨基酸殘基的短肽，它是一種耐酸性物質(zhì)，即使在胃這樣低pH環(huán)境中穩(wěn)定性也很高，能抑制革蘭氏陽性菌如梭狀芽孢桿菌和李氏桿菌。Bacillus spp.產(chǎn)生的桿菌肽mersacidin對“超級耐藥菌”--耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）具有良好的抑制作用，通過腹腔給藥可以清除MRSA感染小鼠血液、肺、肝、腎、脾等臟器中的細菌，并且對小鼠各器官沒有造成明顯的損害[16]。

1.2抗菌肽的理化特性與結(jié)構(gòu)分類

抗菌肽一般具有以下理化特性：（1）一般由10～50 個氨基酸組成，分子量小，熱穩(wěn)定性好，免疫原性低；（2）富含疏水和堿性氨基酸殘基，所以大多數(shù)抗菌肽都帶正電荷且具有兩親性；（3）抗菌肽在較大的離子強度和較低或較高的pH值下仍可保持較強的活性；（4）部分抗菌肽還有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。

不同來源、不同結(jié)構(gòu)的抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)具有較強的保守性，且N 端富含極性氨基酸，絕大多數(shù)抗菌肽的第二位氨基酸殘基是Trp，C 端通常酰胺化，分子中間富含Pro，這些特征對抗菌肽廣譜的殺菌活性的高低起著至關重要的作用，甚至直接影響抗菌肽的殺菌活性。

根據(jù)其化學組成，高級結(jié)構(gòu)以及其功能進行分類可將抗菌肽分為5類: (1) α-螺旋結(jié)構(gòu)類，如天蠶素（Cecropins），蛙皮素（Magainins）等；(2)β-折疊型，該類抗菌肽是在分子內(nèi)有兩個或兩個以上二硫鍵，動物防御素多數(shù)屬此類結(jié)構(gòu)，如綠蠅防御素分子內(nèi)有6個半胱氨酸形成3個分子內(nèi)二硫鍵，肽鏈C末段是帶有擬β轉(zhuǎn)角的反向平行的β片層；(3) 伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類，該類抗菌肽不含半胱氨酸，但富含脯氨酸和精氨酸或色氨酸殘基，如從蜜蜂體內(nèi)分離到的apidaecins中脯氨酸和精氨酸的含量分別高達33% 和17 %，通常由15～34個氨基酸殘基組成在兩親性分子內(nèi)部形成分子內(nèi)α-螺旋； (4) 環(huán)鏈結(jié)構(gòu)類，該類抗菌肽在C末端有一個分子內(nèi)二硫鍵，在C末端形成一個環(huán)鏈結(jié)構(gòu)，而N末端為線狀結(jié)構(gòu)，如青蛙皮膚細胞產(chǎn)生的brevinins和bactenecin均屬于此類；(5)由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽[1]。

2. 抗菌肽的生物活性及作用機制

2.1抗菌肽的抗細菌作用  在APD數(shù)據(jù)庫中有1158個抗細菌肽，至少有113種以上的不同細菌均能被抗菌肽所殺滅?？咕牡目咕饔脵C理的研究比較多。一是基于膜攻擊作用的殺菌機制有一下幾個模型[17, 18]：（1）桶板模型(barrel-stave model)：帶正電荷的含α-螺旋抗菌肽單體與細胞膜上帶負電荷的磷脂分子相互吸引而結(jié)合在細胞膜表面，多個抗菌肽分子形成多聚體，擾亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排序，并以與膜表面垂直的排列方式將疏水基團插到磷脂雙分子層，形成橫跨細胞膜的離子通道，造成細胞質(zhì)物質(zhì)泄漏和電化學勢喪失，細胞膜崩解而導致細胞死亡。（2）地毯模型 (carpet model)：以該機制殺菌的抗菌肽并不插入細胞膜內(nèi)部，但在電荷作用下，一定濃度的抗菌肽像地毯樣展開平行排列在細胞膜表面或形成顆物，利用疏水作用和分子張力作用改變細胞膜的表面張力，從而在細胞膜上出現(xiàn)暫時的孔洞，除了細胞液的相互滲透，抗菌肽還可通過此孔洞進入細胞。此外還有（3）穿孔螺旋模型（toroidal-hole model）：抗菌肽分子的極性端與磷脂分子的極性端相對一起形成以螺旋狀形式的連續(xù)翻轉(zhuǎn)，從而導致膜的完整性破壞和功能喪失；（4）分子團聚集式(micellar aggregate)是抗菌肽分子以不規(guī)則形式聚集于膜表面，類似地毯式模型的作用形成跨膜電勢差而導致膜損傷。二是基于抗菌肽的非膜結(jié)構(gòu)破壞型機制，包括抗菌肽穿過細胞膜或核膜，作用于胞內(nèi)DNA、RNA，酶和蛋白質(zhì)等分子，可抑制細胞外膜蛋白質(zhì)，細胞壁的合成，抑制細胞的呼吸作用。如Carlsson等研究發(fā)現(xiàn)，attacin 能夠抑制大腸桿菌細胞外膜蛋白相關基因的轉(zhuǎn)錄，導致細胞的通透性增加，從而抑制細菌生長[19]。Fehlbaum 等用40µM 的昆蟲抗菌肽thanatin 處理大腸桿菌1 h 后細胞呼吸作用明顯變?nèi)?，處? h 時后呼吸作用則完全停止，從而推斷thanatin 可能是通過抑制細胞的呼吸作用殺滅細菌。

2.2 抗菌肽的抗病毒作用目前在APD數(shù)據(jù)庫中有97個抗病毒肽，研究證明抗菌肽可以3種不同的機制起到抗病毒的作用：（1）可直接與病毒顆粒相互作用，如α-防御素等直接與對皰疹病毒粒子相結(jié)合而起作用；（2）干擾病毒的侵染過程，蜂毒素及其類似物K7I的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒衣殼蛋白的部分氨基酸序列存在相似性，以偽裝成病毒包被蛋白，干擾病毒的正常組裝；（3）抑制病毒的復制，蜂毒素和殺菌肽A可抑制HIV的復制。

2.3 抗菌肽對真菌的作用目前在APD數(shù)據(jù)庫中有97個抗真菌肽。來源于哺乳動物的防御素對一些人類致病真菌具有殺傷作用；截取天蠶素A和蜂毒索分子的片段，合成雜合肽分子處理真菌孢子原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)不但真菌細胞壁無法恢復，而且細胞也被破壞，無法保持正常的細胞形態(tài)。抗菌肽抗真菌的作用機理包括：（1）阻止、破壞真菌細胞壁的合成，如棘球白素（echinocandins）是1,3-β-葡聚糖合成酶的抑制物，通過非競爭性抑制葡聚糖的合成而抑制真菌細胞生長；（2）與真菌細胞內(nèi)線粒體、核酸等大分子細胞器相互作用導致真菌死亡；（3）攻膜作用，在脂膜上形成孔洞，使重要的內(nèi)容物外泄。

2.4 抗菌肽的抗原蟲作用 部分抗菌肽可以有效地殺滅寄生于人類和動物的寄生蟲。殺菌肽的類似物Shiva I在體外可以殺死惡性瘧原蟲[20]；殺菌肽／蜂毒素的雜合肽可以殺傷利什曼鞭毛蟲?？咕臍缂纳x時主要作用于寄生蟲細胞質(zhì)膜，損壞質(zhì)膜形態(tài)，迅速降低W／OH的通透性，破壞膜電勢。

2.5 抗菌肽的抑制腫瘤細胞作用目前在APD數(shù)據(jù)庫中還有95個抗腫瘤肽。腫瘤細胞對抗菌肽的敏感度比正常細胞要高，這可能與腫瘤細胞外膜含有較高的酸性磷脂成分有關，而腫瘤細胞的細胞骨架系統(tǒng)不完善，也可能是易受抗菌肽作用的原因?？咕膶Π┘毎淖饔弥饕强梢圆迦胭|(zhì)膜，使雙分子層發(fā)生融解、完整性被破壞，細胞膜上形成的孔洞使內(nèi)容物外泄，線粒體出現(xiàn)空泡化，嵴脫落，核膜破損，界限模糊不清，核染色體DNA斷裂，并抑制染色體DNA的合成。

抗菌肽的抗腫瘤作用的另外一個可能機制是誘導細胞凋亡。Mai等研究發(fā)現(xiàn)，將抗菌肽DP1局部注射到小鼠的體瘤內(nèi)，DP1 可以迅速誘導腫瘤細胞凋亡，因此誘導細胞凋亡可能是抗菌肽作用機制中的一種[21, 22]?？咕脑隗w內(nèi)還可以調(diào)節(jié)機體的免疫機能，增強機體的免疫力發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.6 抗菌肽具有促進創(chuàng)傷愈合、促進血管生成功能  LL-37在體內(nèi)和體外均可以促進創(chuàng)傷愈合。LL-37可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，活化基質(zhì)蛋白酶，促有絲分裂蛋白酶，激活磷酸激酶信號轉(zhuǎn)導途徑，最終反式激活內(nèi)皮生長因子的表達，促進表皮細胞再生或形成肉芽組織愈合傷口[23]。在體內(nèi)LL-37以劑量依賴性的方式誘導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，角質(zhì)形成細胞生長因子（KGF）等多種細胞生長因子表達，刺激腸上皮細胞生長，保證腸上皮組織屏障的完整性[24]。本室從牛蛙皮膚中分離得到2種具有抗菌活性的多肽，同時檢測到其具有對細菌感染創(chuàng)面促進創(chuàng)傷愈合作用。

2.7 抗菌肽的中和、阻斷內(nèi)毒素的作用  來自人的抗菌肽hCAP18 具有通過結(jié)合并中和、阻斷內(nèi)毒素的作用，10 mg和100 mg hCAP18 均能夠顯著抑制由LPS誘導增加的炎性細胞數(shù)，降低NO，TNF-α，PGE2, MCP-1和MIP-2水平[25, 26]。

2.8 抗菌肽的白細胞趨化與免疫激活作用 感染或損傷處所分泌的Cathelicidins和defensins 對效應細胞具有趨化性, 誘導化學激活素的轉(zhuǎn)錄及分泌和肥大細胞的組胺釋放, 這些反應一起則能促進先天的及獲得性免疫細胞的補充。LL-37是只存在于人腸道的屬于 cathelicidin家族的抗菌肽，具有直接的殺菌活性。LL-37作用宿主Toll樣受體， 加強TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄和增加TLR4，引發(fā)宿主主細胞（mast cell）釋放 IL-4，IL-5，IL-1β，激活宿主的先天性免疫[27]。

2.9 抗菌肽的炎性及免疫抑制作用  LL-37通過多種作用協(xié)同炎癥因子IL-1β等細胞因子的釋放[27, 28]。哺乳動物抗菌肽除了具有促炎性反應外, 也能阻止有害的炎癥應答。Cathelicidin家族的抗菌肽能夠抑制致炎細胞因子如TNF-α，IFN-r和IL-6的相關基因轉(zhuǎn)錄、促炎癥反應物質(zhì)的釋放及避免細菌感染后嚙齒類的膿毒癥, 還能防止引起阻止損傷和炎癥的毒性組分的產(chǎn)生[29-31]，研究表明Cathelicidin家族抗菌肽還可通過調(diào)節(jié)TLR4來調(diào)節(jié)炎癥反應[32]。

2.10 免疫調(diào)節(jié)作用抗菌肽可以通過對靶細胞的凋亡、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)巨噬細胞、樹突狀細胞和其它抗原遞呈細胞趨化性的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)宿主細胞因子的產(chǎn)生和B細胞和T細胞的抗原特異性免疫應答而作用于先天及獲得性免疫[17, 33]。

3 抗菌肽篩選策略

3.1基于分離技術的篩選策略以各種蛋白質(zhì)分離純化技術從組織中直接分離純化是將宿主經(jīng)誘導后取特定組織制成組織勻漿，經(jīng)超速離心、Sephadex -G50層析、反相高效液相色譜或電泳分離等各種蛋白質(zhì)分離純化技術可以得到不同樣品，用MALDI-TOF質(zhì)譜對樣品進行分析和活性測定。從組織中直接分離純化不足之處在于天然含量極微，提取步驟煩瑣、得率低[34]。

3.2 利用差異顯示技術篩選抗菌肽編碼基因利用差異顯示技術對進行誘導和未進行誘導基因的差異表達進行研究，可得到一些新的抗菌肽類相關基因，這是關于基因分離、表達研究的較新的方法。Kim等就利用差異顯示技術分離到了一種新抗菌肽Enbocin。

3.3 基于同源序列篩選抗菌肽編碼基因以細菌誘導動物體產(chǎn)生抗菌肽或直接取特定組織提取mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，根據(jù)已知抗菌肽的DNA序列設計保守的PCR引物或制備寡核苷酸探針，可以在文庫中篩選具有序列同源性的編碼基因，這種策略的應用加速了不同物種間同源抗菌肽的發(fā)現(xiàn)對庫進行測序篩選，用該法可以得到分離純化方法得不到的抗菌活性的多肽[35]。本室以上述方法從牛蛙皮膚獲得了牛蛙皮膚組織抗菌肽粗提物對枯草桿菌、李氏桿菌、綠膿桿菌、李斯特菌、金葡菌有較好的抑菌活性，并結(jié)合cDNA文庫篩選策略獲得多個具有抗菌活性的多肽。

3.4 用生物信息學方法設計和鑒別抗菌肽 生物信息學研究已經(jīng)在擬南芥 、人、鼠、雞等多種模式生物中成功地篩選到了新的抗菌肽或β-防御素基因。生物信息學方法可以用來設計具有特定功能的氨基酸序列，也可以進行抗菌肽的設計?？咕臄?shù)據(jù)庫APD ( http://aps.unmc.edu/AP/main.php) 的建立為用生物信息學研究抗菌肽提供了支持，目前在該數(shù)據(jù)庫中有約2000余種抗菌肽，該數(shù)據(jù)庫具有根據(jù)抗菌肽家族（如細菌素、防御素等），多肽來源（如魚類、蛙類），翻譯后修飾（如酰胺化，氧化，糖基化等），多肽靶向位點（如膜靶向，蛋白靶向，脂多糖靶向等）檢索功能，不同來源抗菌肽的氨基酸殘基特性分析和數(shù)據(jù)庫輔助的多肽設計。Wang等通過該數(shù)據(jù)庫設計出了抗大腸桿菌活性高于人源抗菌肽LL-37的抗菌肽GLK-19[36]。

3.5 其他高通量篩選鑒別抗菌肽的策略 Loit等將表達文庫菌涂在膜支持物上，誘導后挑出陽性克隆測抑菌活性可以快速從表達文庫中高通量地篩選抗菌肽[37]。篩選合成肽庫或噬菌體展示肽庫也是較好的抗菌肽高通量篩選的策略，通過此策略可能得到一系列序列相關的具有抗菌活性的化合物，并可以研究結(jié)構(gòu)與生物活性的關系[38, 39]。Rathinakumar等以穿透人工合成的脂膜為指標，從16384個短肽庫中篩得10個多肽，雖然它們在基序、長度和電荷等特性方面存在較大差異，但具有同穿透性抗菌肽一樣的活性，以些方法篩得到了抗菌活性不依賴于特定基序和三級結(jié)構(gòu)的膜結(jié)活性（interfacial activity）的抗菌多肽[2, 40]，Cherkasov等利用人工智能網(wǎng)絡技術也引入到了抗菌肽的篩選，并篩得到了比常規(guī)方法篩到的抗菌肽抗超級耐藥菌活性更高的多肽化合物[41]。

3.6 抗菌肽的分子設計伴隨每一種新抗菌肽的發(fā)現(xiàn)，都會進行氨基酸序列的修飾，目的是尋找對抗菌活性影響的關鍵部位，并進一步進行分子設計，以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。對天然抗菌肽進行序列修飾包括以下內(nèi)容，即增加、刪除、或替代1個或多個殘基，截取肽鏈N端或C端部分序列，連接不同自然來源的抗菌肽片段成為雜合肽等。蛙皮膚抗菌肽ascaphin-8和 XT-7具有廣譜的抗菌活性，但因?qū)Σ溉閯游锛毎卸拘宰饔枚荒苡糜谂R床，通過將ascaphin-8 的Ala(10), Val(14)和 Leu(18)殘基替換為L-Lys 或 D-Lys，將XT-7的Gly(4) 替換為L-Lys，增加了抗菌肽分子兩親性，減少了螺旋數(shù)和疏水性，保持了原有抗菌活性并且降低了毒性[42]。Ahmad等以研究了?？咕腂MAP-28的N- 和 C-末端鋅指結(jié)構(gòu)與功能的基礎上，用丙氨酸殘基替換亮氨酸或異亮氨酸殘基，設計出了具有細胞選擇性的七價重復序列的BMAP-28類似物，具有更低的毒性作用[43]，而Jenssen等利用可以計算相鄰氨酸殘基間能量的兩個數(shù)學模型可以準確地預測出測試多肽或生物活性[44, 45]。

4 抗菌肽的應用前景

4.1抗菌肽作為新型抗生藥物，在疾病治療與預防中具有廣闊的應用前景?？咕氖且环N很有潛力的新抗菌藥物來源，是一個方興未艾的領域，隨著研究的不斷深入，會有一大批新型抗菌肽被發(fā)現(xiàn)，可望成為新型的抗菌和抗腫瘤藥物在臨床上應用，具有廣譜抗菌且有獨特的抗菌機制的抗菌肽顯然在克服細菌耐藥性方面具明顯優(yōu)勢。目前已有十余種抗菌肽進行臨床前或臨床研究，隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關系、抗菌肽作用機制及其基因表達調(diào)控機制認識的不斷深化，設計一種高效的、有利于人類健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。

4.2 抗菌肽可能成為一種新型的藥物載體。兩親性抗菌肽的膜穿透性是其作為藥物運輸載體的基礎，Laszlo Otvos等將分子量小且富含精氨酸殘基的昆蟲抗菌肽pyrrochoricin和其衍生物作為施藥運載工具，可將抗原性較弱的9個殘基的MHC-1的抗原表位遞送到小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生很強的細胞毒性T細胞反應，證實pyrrochoricin 同系物具有運載抗原依賴性疫苗的潛力[46]。Magainin 與溶于50%乙醇的表面活性劑增強劑N-月桂酰肌氨酸一起可以破壞皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而增加了藥物的皮膚透過性，該結(jié)果顯示出抗菌肽作為透皮給藥載體具有很好的發(fā)展前景[47-49]，進一步探討抗菌肽作為穿膜肽的應用具有廣闊的前景。

4.3抗菌肽類食品防腐劑。天然防腐劑的研究和開發(fā)利用成了食品工業(yè)的一個熱點。由于抗菌肽類防腐劑所具有的安全無毒害，甚至對人體有一定營養(yǎng)保健作用等優(yōu)點，其研究開發(fā)無疑是一個很有前途的重要課題。乳酸鏈球菌素(Nisin)能夠抑制部分革蘭氏陽性菌的生長，尤其是可形成芽孢的細菌，Nisin 能阻止梭菌的生長與毒素形成，抗菌效果更強。Nisin 的應用與其它防腐劑相比，具有用量少、使用方便、防腐效果好、價格低廉的特點，使用它還可降低殺菌溫度，減少熱處理時間，因此能改進食品營養(yǎng)價值、風味、結(jié)構(gòu)、顏色等性狀。

4.4 抗菌肽作為畜禽飼料添加劑在畜牧業(yè)的應用。抗生素添加劑的使用嚴重破壞了動物腸道的微生物平衡，并易在動物體內(nèi)殘留，嚴重影響產(chǎn)品的品質(zhì)和人類的健康。用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型抗菌肽添加劑或者通過日糧因素調(diào)控抗菌肽基因的表達而達到畜產(chǎn)品無抗生素化值得進一步研究。本室以中國鱟抗菌肽tachyplesins I 、polyphemusins 、乳酸菌素Gassericin T 、中國林蛙皮膚抗菌肽RC基因酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)物制備的抗菌肽制劑肽百康在雞飼糧中的添加量達500g/t時，不但能有效地抑制飼料中細菌的繁殖，顯著增加雞的平均日增重，提高對雛雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)，作用最為明顯。

4.5 抗菌肽在畜禽疾病治療與預防中的應用。柞蠶抗菌肽應用于預防及治療雞白痢效果明顯。陳曉生等報道，飼料中添加抗菌肽對肉鴨有促進生長的作用，應用含抗菌肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬料，飼喂試驗結(jié)果表明可減輕斷奶仔豬腹瀉。Wang等研究表明飼喂豬腸抗菌肽SGAMP能增強SPF雞的粘膜免疫[50]。本室研制的抗菌肽制劑肽百康作為豬飼料添加劑可提高仔豬的日增重同時具用預防腹瀉的作用，尤以基礎日糧中添加320g/噸肽百康效果最好，應用于斷奶應激期間的仔豬抗腹瀉取得了與抗生素預防相同的作用效果。

4.6 抗菌肽作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應用。水產(chǎn)養(yǎng)殖中在餌料中大量使用抗生素作為添加劑, 不僅破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的正常菌群, 而且易在動物體內(nèi)殘留。基因工程抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素或作為環(huán)保型餌料添加劑，既可以增強水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的抗病能力, 又可以提高養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量。

4.7 轉(zhuǎn)抗菌肽基因動物氣管黏膜抗菌肽在小鼠乳腺組織表達，重組肽對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌以及白色念珠菌均具有抗菌活性。近年來，將對病原生物有抑制作用的抗菌肽基因?qū)雮鞑ソ轶w(蚊) 中,使其在昆蟲體內(nèi)高效穩(wěn)定的表達，從而切斷病原物的傳播途徑。

4.8 轉(zhuǎn)抗菌肽基因植物培育抗病新品種是防治植物病害的根本途徑。業(yè)已完培育成功的抗病轉(zhuǎn)抗菌肽基因植物有抗梨火疫病轉(zhuǎn)基因蘋果樹，抗煙草野火病、煙草花葉病毒病的轉(zhuǎn)基因煙草，抗水稻白葉枯病轉(zhuǎn)基因水稻，抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草等[51]，將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物是培育作物抗病新品種的有效策略。

5 抗菌肽研究存在的問題

目前，研發(fā)綠色、新型、高效、低毒、廣譜的抗菌制劑已成為全球的熱潮。新型抗菌肽不斷被發(fā)現(xiàn)，天然抗菌肽的人工修飾最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。

雖然抗菌肽的研究時間不長，大量研究結(jié)果預示，抗菌肽的應用將帶來生物醫(yī)藥領域的一場“綠色革命”，但magainin，indolicidin，protegrin等體外抗菌活性較好的抗菌肽已進入臨床超過10年，還存在抗菌活性較弱，非特異性毒性作用和對蛋白酶敏感等問題而限制其應用[52]。真正將抗菌肽推向市場，應用于臨床可能還要面臨很多挑戰(zhàn)，還必須繼續(xù)深入研究以下幾個問題。

5.1 抗菌肽的來源問題在動物體內(nèi)天然含量極微，天然資源有限；其次，抗菌肽分子量小，分離純化困難，提取步驟煩瑣、得率低；再次，抗菌肽化學合成成本高，價格昂貴。如何提高抗菌肽的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本的難題成為目前抗菌肽研究與應用的瓶頸。

5.2抗菌肽的活性問題雖然基因工程抗菌肽在一級結(jié)構(gòu)上與天然抗菌肽一致，卻無法保證空間結(jié)構(gòu)上的一致而造成活性差異。另外，天然防腐劑的抗菌譜較窄，客觀上使其應用領域受到了限制。

5.3抗菌肽的毒性問題至今尚無資料表明抗菌肽的體內(nèi)毒性問題。但抗菌肽可能會引起過敏反應，僅用于局部治療；許多天然抗菌肽都有溶血性。

5.4 抗菌肽的功能與結(jié)構(gòu)的關系問題 目前，天然來源的抗菌肽已不能滿足進一步對其作用機理及其高級結(jié)構(gòu)研究的需要。

5.5 抗菌肽的體內(nèi)穩(wěn)定性問題抗菌肽一級結(jié)構(gòu)中由于含有多個堿性氨基酸殘基(如賴氨酸、精氨酸)而容易被胰蛋白酶水解，從而限制了抗菌肽作為抗感染藥物的體內(nèi)使用。開發(fā)同時具有抗菌活性與胰蛋白酶抑制劑活性的雙功能多肽，為解決抗菌肽作為藥物的體內(nèi)使用遇到的蛋白酶水解問題提供了新的方法。

5.6 抗菌肽的耐藥性問題由于抗菌肽或者細胞應激反應因子觸發(fā)病原體產(chǎn)生的一種耐藥性機制，這種機制包括：微生物對抗菌肽的應激協(xié)同反應，蛋白酶介導的耐藥性，細胞內(nèi)外靶位的修飾和抗菌肽的外排作用等[53]。例如：Perron等在實驗室中對E. coli和 P. fluorescens 進行持續(xù)600~700 代的篩選，22/24譜系獨立進化出了可遺傳的對陽離子抗菌肽exiganan 的耐藥性[54]。金黃色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解抗菌肽產(chǎn)生耐藥性外[55]，還可以通調(diào)節(jié)vraDE和vraSR 改變膜的轉(zhuǎn)運作用而產(chǎn)生對蛙類抗菌肽temporin L和dermaseptin K4-S4的耐藥性[56]。

5.7 抗菌肽在生命體防御系統(tǒng)中準確地位以及模式生物研究抗菌肽表達水平與各種疾病具有相關性?？咕摹⒎烙嘏c消化系統(tǒng)疾病如幽門螺桿菌感染、炎癥性腸病、消化道腫瘤的關系已成為研究熱點，但缺少用于研究的生物模型而制約研究的發(fā)展。

5.8 抗菌肽的基因工程表達存在的問題基因工程表達抗菌肽存在的問題主要有：抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，缺乏檢測抗菌肽方法?；虻谋磉_產(chǎn)物可能對宿主有害。目的基因在宿主基因組中的隨機整合有可能造成宿主染色體突變，同時也可能影響其他基因的表達。轉(zhuǎn)抗菌肽基因動植物陽性率偏低及其最終應用時的安全性還有待研究等。

尋找有效的抗生素的道路困難重重，開發(fā)出一種新的抗生素需要耗時日久。在抗生素耐藥性日益嚴重、病毒病和腫瘤仍未攻克的今天，抗菌肽的出現(xiàn)無疑為人們尋找理想的抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物提供了新的領域，抗菌肽的應用將給解決細菌抗藥性、藥物殘留等關鍵問題帶來希望。新型、高效、低毒、廣譜的抗菌肽將會在農(nóng)業(yè)、食品、衛(wèi)生用品、醫(yī)藥、化妝品、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動植物抗病基因工程等領域發(fā)揮重要的作用，為人類創(chuàng)造巨大的價值。

（本文由作者根據(jù)第二屆中國獸藥大會“學術論壇”韓文瑜教授演講稿整理而成）