豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范（國標(biāo)）

qinggesun

中華 人民共 和 國國家標(biāo) 準(zhǔn)
GB  1 6 5 5 1 一1 9 9 6
豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范
1 主題內(nèi)容與適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬瘟群體檢疫、 個(gè)體檢疫、 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、 綜合判定和檢疫后處理的技術(shù)規(guī)范。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬瘟的檢疫。
2 引用標(biāo)準(zhǔn)
     G B  1 6 5 4 8 -1 9 9 6 畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程
3 群體檢疫
3 門 經(jīng)核實(shí)已按規(guī)定接種合格的豬瘟疫苗， 注射后一月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟的患豬， 并處在免疫有效期
內(nèi)， 可認(rèn)為免疫符合要求。如未接種疫苗， 或接種不符合要求， 或接種后又發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟的病豬， 必須進(jìn)
行補(bǔ)充免疫接種， 至免疫有效期開始未發(fā)生異常， 可認(rèn)為免疫合格; 如免疫接種后再發(fā)生疑似豬瘟患豬，
必須進(jìn)行臨床檢查、 解剖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查， 在排除豬瘟染疫的可能性之后， 方可認(rèn)為免疫合格。
3 . 2 檢查全群的健康狀況， 有否異常表征。如發(fā)現(xiàn)豬群中被檢豬只體溫在4 0 .  5 ℃以上， 倦怠、 食欲不
振、 精神萎頓， 可視粘膜充血、 出血或有不正常分泌物、 發(fā)給、 便秘腹瀉交替， 或其他疑似豬瘟的癥狀， 作
可疑豬瘟對待， 全群隔離飼養(yǎng)， 作進(jìn)一步診斷。
     此外， 仔豬有衰弱、 震顫或發(fā)育不良等現(xiàn)象時(shí)， 可懷疑母豬攜帶豬瘟病毒， 應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診。
13 對群體中檢出的可疑患豬可抽樣進(jìn)行解剖檢查， 下述病變作為綜合診斷定性的依據(jù)之一:
     a 腎皮質(zhì)色澤變淡， 有點(diǎn)狀出血;
     b ， 淋巴結(jié)外觀充血腫脹， 切面周邊出血， 呈紅白相間的“ 大理石祥” ;
     c . 脾臟不腫大， 邊緣發(fā)現(xiàn)楔狀梗死區(qū);
     d . 喉頭、 膀朧有小點(diǎn)出血;
     e . 全身出血性變化， 多呈小片或點(diǎn)狀;
     f 回盲瓣、 回腸、 結(jié)腸形成“ 鈕扣狀腫” ( 慢性豬瘟) ;
     9 . 公豬包皮積尿。
3 . 4 經(jīng)檢疫認(rèn)為免疫合格， 臨床檢查無異常; 或發(fā)現(xiàn)疑似病例， 經(jīng)解剖檢查、 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)等綜合性診斷，
證明不是豬瘟， 應(yīng)作為非豬瘟群對待。 但易地飼養(yǎng)時(shí)， 必須先隔離兩周以上， 經(jīng)觀察無異常方準(zhǔn)與當(dāng)?shù)刎i
群混養(yǎng)。
4 個(gè)體檢疫
     豬只作為單個(gè)檢疫對象時(shí)， 應(yīng)進(jìn)行認(rèn)真的個(gè)體檢疫。
4 . 1 個(gè)體檢疫的內(nèi)容包括:
     a . 查明產(chǎn)地有否疫情或查驗(yàn)產(chǎn)地檢疫證明;
     b . 查驗(yàn)防疫證明;
國家技術(shù)監(jiān)督局1 9 9 6 一 1 0 一 0 3 批準(zhǔn) 1 9 9 7 一 0 2 一 0 1實(shí)施GB  1 6 5 5 1 一1 9 9 6
     c . 臨床檢查。
4 . 2 如上述三項(xiàng)均無疑問， 可作為豬瘟非疫豬對待。
4 . 3 如4 .  l c 項(xiàng)無問題， 而4 .  l a , b 兩項(xiàng)有問題， 可再次補(bǔ)充免疫接種， 隔離1 5日無異常按非豬瘟豬對
待。如免疫后有可疑癥狀， 應(yīng)繼續(xù)隔離觀察， 如仍不能確診， 須進(jìn)行解剖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。
4 . 4 如4 .  l a , b 兩項(xiàng)無間題， 4 .  l c 項(xiàng)有問題應(yīng)隔離觀察， 如仍不能確診， 須作解剖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。
5 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)
5 . 1 有下列情形之一者應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn):
     a . 產(chǎn)地定期檢疫;
     b 非疫區(qū)對從外地引進(jìn)的豬進(jìn)行全群檢查或抽檢;
     c . 發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟患豬或“ 非典型豬瘟” ， 母豬繁殖障礙和仔豬先天性痙攣病例須予確診;
     d . 原認(rèn)為非疫群中或從非疫區(qū)引進(jìn)豬群中發(fā)現(xiàn)可疑豬瘟或病毒攜帶者， 須予確診;
     e . 發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟暴發(fā)流行， 在采取緊急防治措施的同時(shí)須作出確切診斷， 或解除封鎖前須查明豬
體帶毒情況;
     f 有重大疫病( 如非洲豬瘟) 嫌疑須作出鑒別診斷;
     S . 交易雙方共同要求， 或農(nóng)牧主管部門要求進(jìn)行確診;
     h . 經(jīng)群體檢疫或個(gè)體檢疫， 需要進(jìn)一步確診者。
52 下述方法， 其試驗(yàn)結(jié)果可作為檢疫定性的依據(jù)之一。
5 . 2 . 1 兔體交叉免疫試驗(yàn)， 見附錄A( 補(bǔ)充件) 。
5 . 2 . 2 免疫酶染色試驗(yàn)， 見附錄B ( 補(bǔ)充件) 。
5 . 2 .  3 病毒分離與增毒試驗(yàn)， 見附錄C ( 補(bǔ)充件) 。
5 . 2 . 4 直接免疫熒光抗體試驗(yàn)， 見附錄D ( 補(bǔ)充件) 。                       價(jià)
6 綜合判定
     發(fā)病不分年齡、 季節(jié)， 臨床癥狀明顯， 解剖檢查病變典型， 用5 .  2中任一試驗(yàn)獲陽性結(jié)果; 或臨床癥
狀和發(fā)病情況不詳， 尸體解剖檢查病變典型, 5 . 2中所列任一試驗(yàn)獲陽性結(jié)果; 發(fā)病情況、 臨床癥狀、 病
理變化不詳、 不明顯或不典型， 但 5 . 2中所列試驗(yàn)的兩項(xiàng)獲陽性結(jié)果; 這些情況均可判定為豬瘟病毒感
染豬。
了 檢疫后處理
在群體或個(gè)體檢疫中， 凡經(jīng)綜合判定為豬瘟者， 其群體或個(gè)體一律按G B  1 6 5 4 8 處理。G B  1 6 5 5 1 一1 9 9 6
     附 錄 A
兔體交叉免疫試驗(yàn)
     ( 補(bǔ)充件)
     將病豬的淋巴結(jié)和脾臟， 磨碎后用生理鹽水作1 : 1 0 稀釋， 對3 只健康家兔作肌肉注射， 5  mL / 只，
另設(shè)3只不注射病料的對照兔， 間隔5d對所有家兔靜脈注射 1: 2 0的豬瘟兔化病毒( 淋巴脾臟毒) ，
1  m L / 只。 2 4  h 后， 每隔6 h 測體溫一次， 連續(xù)測9 6  h ， 對照組2 / 3 出現(xiàn)定型熱或輕型熱， 試驗(yàn)成立。 試驗(yàn)
組的試驗(yàn)結(jié)果判定見表A i .
                             表A 1 兔體交叉免疫試驗(yàn)結(jié)果判定
接種病料后體溫反應(yīng) 接種豬瘟兔化弱
毒后體溫反應(yīng) 結(jié)果判定
含豬瘟病毒
+ 不含豬瘟病毒
+ 含豬瘟兔化病毒
十 + 含非豬瘟病毒熱原性物質(zhì)
注: “ +” 表示多于或等于三分之二的動(dòng)物有反應(yīng)
   附 錄 B
免疫酶染色試驗(yàn)
     ( 補(bǔ)充件)
B 1 解剖檢查時(shí)采病畜扁桃體、 脾、 腎、 淋巴結(jié)作壓印片或冰凍切片。標(biāo)本自然干燥后， 在2 %戍二醛和
甲醛等量混合液中固定1 0  mi n ， 干后， 置冰箱內(nèi)待檢。
     操作方法:
B 1 門 將標(biāo)本浸入。0 1 %過氧化氫或0 . 0 1 %迭氮鈉的T r i s - H C I 緩沖液中， 室溫下作用3 0  mi n ,
B 1 .  2 用p H 7 .  4  0 .  0 2  m o l / L磷酸緩沖鹽水漂洗5 次， 每次3  m i n ， 風(fēng)干。
B 1 .  3 將標(biāo)本置于濕盒內(nèi)， 滴加1: 1 0 酶標(biāo)記抗體， 覆蓋標(biāo)本面上， 置3 7 ℃作用4 5  m i n .
B 1 .  4 用p H  7 . 4  0 . 0 2  m o l / L磷酸緩沖鹽水一 1 %吐溫緩沖液漂洗5 次， 每次2 -3  m i n .
B 1 .  5 將標(biāo)本放入D A B  (  4 一 二甲氨基偶氮苯) T r i s - H C I 液內(nèi)， 置3 7 ' C 溫箱作用3  mi n .
B 1 .  6 用p H  7 .  4  0 .  0 2  m o l / L磷酸緩沖鹽水沖洗3 -4 次， 每次2 ^ - 3  m i n ， 再用無水酒精、 二甲 苯脫水，
封片檢查。
B 1 . 7 用顯微鏡檢查， 如細(xì)胞漿染成深褐色為陽性; 黃色或無色為陰性。 豬瘟兔化弱毒接種的豬組織細(xì)
胞漿成微褐色， 與強(qiáng)毒株感染有明顯區(qū)別。
       附 錄 c
病毒分離與增毒試驗(yàn)
       ( 補(bǔ)充件)
     本試驗(yàn)可用來分毒和擴(kuò)增病毒數(shù)量以提高檢疫的敏感性。
c l 將2 g扁桃體或脾臟， 剪成小塊， 加上滅菌砂在乳缽中研成勻漿。 用H a n k ' s 液或ME M配成2 0 懸GB  1 6 5 5 1 一1 9 9 6
液， 加上青霉素( 使終濃度為5 0 0 單位/ m L ) 和鏈霉素( 使終濃度為5 0 0  p g / m L ) ， 室溫下放置1  h ,
3  0 0 0  r / m i n 離心1 5  m i n ， 取用上清液。
C 2 將P K 1 5 單層細(xì)胞用胰酶消化分散后， 8 0 0  r / m i n 離心1 0  m i n ， 用含無B V D V的5 %胎牛血清的
ME M配成2 X1 0 ‘ 個(gè)細(xì)胞/ m L懸液。
C 3  9 份細(xì)胞懸液( C 2 ) 加1 份病料懸液( C 1 ) 接種于轉(zhuǎn)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板。 另設(shè)不加病料的對照若干
瓶( 孔) ， 于接種后1 , 2 , 3  d ， 分別將2 瓶( 孔) 培養(yǎng)物及1 瓶( 孔) 對照用H a n k ' s 液或ME M洗滌2 次， 每
次5  mi n ， 用冷丙酮固定1 0  m i n ,
C Q 進(jìn)行免疫酶染色或免疫熒光染色， 鏡檢。
       附 錄 D
直接免疫熒光抗體試驗(yàn)
       ( 補(bǔ)充件)
D1 采樣
     群體檢疫中， 待檢可疑豬不少于三例， 其中至少二例為早期患豬， 剖殺后或從活體摘取口愕扁桃體。
后期病豬剖殺后采扁桃體和腎臟。個(gè)體檢疫中， 剖殺可疑豬采扁桃體和腎臟。所采組織樣品必須新鮮。
D2 送檢
     采樣后應(yīng)盡快送檢， 如當(dāng)日不能送出， 必須凍結(jié)保存， 避免組織腐敗、 自 溶。
D 3 切片
     將樣品組織塊修切出1  c mxl  c m的面， 不經(jīng)任何固定處理， 直接凍貼于冰凍切片托上( 組織塊太小
時(shí)， 如活摘的扁桃體可用冰凍切片機(jī)專用的包埋劑或化學(xué)漿糊包埋) ， 進(jìn)行切片。切片厚度要求
5 -7  p m。將切片展貼于。 . 8 -1  m m厚的潔凈載玻片上。
D Q 固定
     將切片置純丙酮中固定1 5  mi n 。取出立即放入。 .  0 1  mo l / L , p H7 .  2的磷酸緩沖鹽水中， 輕輕漂洗
3 -4 次。取出， 自然干燥后， 盡快進(jìn)行熒光抗體染色。
D 5 熒光抗體染色
     將豬瘟熒光抗體滴加于切片表面， 置濕盒內(nèi)于3 7 ℃作用3 0  m i n 。取出后放人磷酸緩沖鹽水中充分
漂洗， 再用。5  m o l / L , P H 9 .  0 -9 .  5 碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片( ( 0 .  1 7  m m厚) 。 染色后應(yīng)盡快鏡檢。 必要
付可低溫保存待檢。
D6
D7
鏡檢
將染色后的切片標(biāo)本置激發(fā)光為藍(lán)紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。
判定
     于熒光顯微鏡視野中， 見扁桃體隱窩上皮細(xì)胞或腎曲小管上皮細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光， 判
為豬瘟病毒感染陽性。GB  1 6 5 5 1 一1 9 9 6
附加說明:
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所負(fù)責(zé)起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人楊承諭、 鄭志剛、 仰惠芬、 邵振華。

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