多克隆抗體的制備

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多克隆抗體的制備

一、抗原抗體反應(yīng)

二、多克隆抗體制備原理

三、抗原的制備與純化

四、抗原純度的鑒定方法

五、免疫佐劑

六、免疫動物的選擇

七、動物的免疫

八、多克隆抗體制備的方法

九、抗血清效價及純度鑒定

十、抗血清的純化和保存

一、抗原抗體反應(yīng)

（一）抗原

1 抗原的概念：抗原（antigen,Ag)：是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體和致敏淋巴細(xì)胞)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖膬煞N特性：免疫原性和抗原性免疫原性（immunogenicity),即能與TC 或BC 抗原受體結(jié)合，刺激細(xì)胞活化、增殖、分化，產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的性能?？乖裕?/font>antigenicity),能與相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的性能。

2 抗原的分類：根據(jù)抗原的性質(zhì)分類：完全抗原（complete antigen）同時具備抗原性和免疫原性的物質(zhì)。半抗原（hapten）（incomplete antigen）只有抗原性而不具有免疫原性的物質(zhì)。半抗原與蛋白質(zhì)類物質(zhì)結(jié)合可具有免疫原性即成為完全抗原。賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)稱為載體。依抗原不同的物理性狀分類：顆?？乖杭?xì)胞，微生物之類屬顆?？乖?；可溶性抗原蛋白質(zhì)一般屬于可溶性膠體抗原。顆粒性抗原的免疫原性一般強(qiáng)于可溶性膠體抗原的免疫原性。

3 抗原的免疫原性：

異物性：抗原的異物性（foreignness）是指一種物質(zhì)被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別為非己的抗原異物的特性，特指外源性物質(zhì)。外源性抗原作為異物一般具有免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，最終被機(jī)體清除，如感染的病原微生物。異物性的物質(zhì)包括以下幾類：① 異種物質(zhì)如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產(chǎn)物對人體而言都是異種物質(zhì)，具有強(qiáng)的免疫原性；② 同種異體物質(zhì)如：ABO 血型抗原、人類主要組織相容性抗原； ③ 自身抗原物質(zhì) 如：自身組織成分結(jié)構(gòu)改變、隱蔽性自身成分暴露構(gòu)成自身抗原。

一定的理化性狀：大分子膠體物質(zhì)凡具有免疫原性的物質(zhì)，分子量都較大，一般在10kDa 以上,在一定范圍內(nèi),分子量越大免疫原性越強(qiáng)。一定的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)從化學(xué)組成來看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白質(zhì)，其免疫原性較強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜其免疫原性越強(qiáng)。分子構(gòu)象與易接近性分子構(gòu)象是指抗原分子中一些特殊化學(xué)基團(tuán)的三維結(jié)構(gòu)，它決定抗原分子是否能與淋巴細(xì)胞表面的抗原受體相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化學(xué)基團(tuán)與淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)的抗原受體相互接觸的難易程度。完整性：具有一定理化性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進(jìn)入機(jī)體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細(xì)胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結(jié)構(gòu)，就喪失了免疫原性。自然界中天然的抗原物質(zhì)有：蛋白質(zhì)、多糖、核蛋白。

宿主遺傳性：抗原的免疫原性也與機(jī)體的應(yīng)答能力有關(guān), 同種動物不同個體對同一種抗原的免疫應(yīng)答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應(yīng)答的基因稱為免疫應(yīng)答基（immune response,Ir)。

4 抗原的特異性：抗原特異性（antigenic specificity）：是指抗原與其受體（TCR 和BCR）和免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體專一結(jié)合的性質(zhì)。即抗原物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體被淋巴細(xì)胞識別，產(chǎn)生的是針對蛋白質(zhì)、多糖及其它大分子抗原物質(zhì)的不同構(gòu)成部位特異的免疫答。

抗原決定簇（基）（antigenic determinant,AD) 被抗原受體TCR 和BCR 特異性識別的抗原部分稱為抗原決定基或表（epitope)。是抗原特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。體內(nèi)存在的具有不同特異性的淋巴細(xì)胞克隆能識別不同的抗原決定基。表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)象決定著抗原的特異性?？乖ㄟ^AD 與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。一個抗原分子可以有一種或多種不同的AD ，一種AD 決定著一種特異性，多種AD決定著多種特異性。

載體決定基和半抗原決定基：一個抗原分子具有載體決定簇和半抗原決定簇。

載體效應(yīng)：初次免疫和再次免疫時，半抗原需要在相同的載體上才能使機(jī)體產(chǎn)生抗半抗原抗體，稱為載體效應(yīng)，在免疫應(yīng)答中，B 細(xì)胞識別半抗原決定簇，是抗體產(chǎn)生細(xì)胞，T 細(xì)胞識別載體決定簇，是輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體。半抗原決定簇又稱B 細(xì)胞決定簇；載體決定簇又稱T 細(xì)胞決定簇。

（二）抗體

抗原刺激機(jī)體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白就是抗體，是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，主要存在于血清等體液中。

（三）抗原抗體反應(yīng)

抗原抗體反應(yīng):是指抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。

原理：抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原分子表面的抗原決定定簇與抗體分子高變區(qū)之間

的互補(bǔ)結(jié)合，在適宜條件下出現(xiàn)可見反應(yīng)。這種互補(bǔ)性是由抗原、抗體分子的空間構(gòu)型所決

定的，是抗原決定簇與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合。抗原抗體之間的結(jié)合力參與并促

進(jìn)抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物。

抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：

1 Ag 與Ab 結(jié)合的特異性（Lock and Key Concept）：抗原與抗體的結(jié)合具有高度特異性，即一種抗原通常只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。是由抗原決定簇與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性所決定的。這種特異性如同鑰匙和鎖的關(guān)系

2 可逆性：抗原與抗體的結(jié)合為非共價的可逆性結(jié)合，它們之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)程度不同，結(jié)合力強(qiáng)弱也不一樣，互補(bǔ)程度越高，則親和力越大。氫鍵（ Hydrogen bonds）、離子鍵（Electrostatic bonds）、范德華力（Van der Waal forces）、疏水力（Hydrophobic bonds）。

抗體的親和力（ affinity ）指一個抗體的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原決定簇之間以非共價鍵相互作用強(qiáng)度。

抗體的親合力（avidity）指抗體多價情況下對抗原的結(jié)合力稱為親合力。與單價Ig 的親和力、Ig 的價數(shù)、抗原決定簇的數(shù)目有關(guān)。

3 比例性在抗原抗體特異性反應(yīng)時，抗原抗體復(fù)合物的生成量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。在恒定量的抗體中逐漸加入抗原量，免疫復(fù)合物的沉淀量逐漸增加然后又逐漸減少。

抗體過剩區(qū)：抗原總量不足以和全部抗體反應(yīng)，在上清中可檢測到游離的抗體，此為前帶現(xiàn)象（prezone)；

等價區(qū)：加入的抗原量足以結(jié)合所有的抗體上清中檢測不到游離的抗原或游離的抗體；

抗原過剩區(qū)：抗原量多于結(jié)合所有抗體所需的量，導(dǎo)致被沉淀（或被凝集）的抗體減少，此為后帶現(xiàn)象（postzone)

4 階段性Ag-Ab 反應(yīng)的兩個階段：Aggregation and Precipitation or agglutination。

（四）抗原抗體反應(yīng)的影響因素

① 抗原：抗原的理化性狀、抗原決定簇的種類和數(shù)目。

② 抗體：特異性和親和力、抗體來源、效價。

③ 電解質(zhì)：常用0.85%NaCl 溶液或各種緩沖液作Ag 及Ab 的稀釋液及反應(yīng)液。；

④ 酸堿度：抗原抗體必須在合適的pH 環(huán)境中進(jìn)行?？乖贵w反應(yīng)一般在pH 為6~9為宜。

⑤ 溫度：適當(dāng)?shù)臏囟燃铀倏乖贵w反應(yīng)的進(jìn)行。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37oC

（五）抗原抗體復(fù)合物解離

抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素:：① 抗體對相應(yīng)抗原的親和力；② 環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。高親和性抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原表位的空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離；低親和性抗體與抗原結(jié)合形成的復(fù)合物較易解離。解離后的抗原或抗體均能保持未結(jié)合前的結(jié)構(gòu)、活性及特異性。

（六）交叉反應(yīng)

共同抗原：兩種來源不同的抗原，除各有其主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱為共同抗原

交叉反應(yīng):
一種共同抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)。

二、多克隆抗體制備原理

1 多克隆抗體的概念

多克隆抗體：在含有多種抗原決定簇的抗原刺激下，體內(nèi)多個 B 細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對多種不同表位的單克隆抗體，其混和物為多克隆抗體。★ 機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生多克隆免

疫血清實質(zhì)上是由多種抗體組成的混合物，又稱多克隆抗體。

2 多克隆抗體產(chǎn)生原理

初次反應(yīng)的抗體持續(xù)時間較短，親和力也較低，多無實際應(yīng)用價值。機(jī)體初次接觸抗原后，激發(fā)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。在Mø 和Th 的作用下，B 細(xì)胞被激活,增生分化為漿細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞（Bm）。漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。由于初次反應(yīng)時，只有少量對該抗原特異的免疫活性細(xì)胞被誘導(dǎo)而增生分化為漿細(xì)胞。隨著抗原的消耗，抑制T 細(xì)胞（Tc）的激活和循環(huán)抗體的反饋抑制作用，漿細(xì)胞減少，抗體滴度很快下降。

二次反應(yīng)產(chǎn)生的抗體主要是高親和力的IgG。

機(jī)體再次受同一抗原刺激后，對該抗原特異性的Bm 迅速增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。Th 的記憶細(xì)胞也加快反應(yīng)的進(jìn)行，在抗原作用1~2 天后，抗體滴度迅速上升?？贵w合成率為初次反應(yīng)的幾倍到幾十倍。

三、抗原的制備與純化

1 顆粒抗原制備

細(xì)胞抗原：自然界中某些細(xì)胞組分的抗原性不僅取決于組成它的蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)，有時也要求完整的二級結(jié)構(gòu)甚至三級結(jié)構(gòu)。將細(xì)胞組分整體分離直接免疫動物會得到事半功倍的效果。

利用細(xì)胞個組分質(zhì)量大小的不同，通過密度梯度離心的方法，在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中，各組分沉降于離心管內(nèi)的不同區(qū)域，分別收集，即可得到所需組分。

細(xì)菌類抗原：細(xì)菌類抗原首先應(yīng)該選好免疫用菌株，在適宜條件下培養(yǎng)增殖，刮取菌苔，經(jīng)殺菌后稀釋成適當(dāng)濃度作為抗原液。

2 可溶性抗原制備與純化

可溶性抗原包括蛋白質(zhì)、多肽、脂蛋白、鐵蛋白、類脂、糖蛋白、細(xì)菌毒素、酶、補(bǔ)體等均為良好的抗原。為制備特異性高的抗血清一般均需加以純化?？乖兓Ｓ玫姆椒ǎ褐行喳}沉淀法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法、免疫吸附親和層析法。

3 半抗原的免疫原制備法

半抗原：多肽，甾族激素，藥物，脂肪胺，核苷等小分子物質(zhì)僅能與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，而它們本身并不是免疫原，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

半抗原免疫原制備: 將小分子半抗原制備成免疫原通常可用物理吸附方法和化學(xué)方法。

物理吸附方法: 通過電荷和微孔吸附半抗原。

物理吸附劑有：碳粉，聚乙，葡聚糖硫酸鈉，甲基纖維素等。

化學(xué)方法: 應(yīng)用某些功能團(tuán)試劑把半抗原連接到載體上。

載體: 包括血清蛋白（牛血清白蛋白，甲狀腺球蛋白，血藍(lán)蛋白，卵白蛋白以及人工合成的多聚賴酸等。半抗原結(jié)合到載體上的數(shù)目直接與抗體生成有關(guān)，半抗原連接在載體上的數(shù)目至少有20 個以上，才能有效地產(chǎn)生抗體。

四、抗原純度的鑒定方法

蛋白質(zhì)抗原純化以及抗血清制備后均需作純度鑒定，通常采用的鑒定方法有

1、醋酸纖維薄膜電泳，此法可以初步鑒定抗原純度，不需要抗血清，較為方便。

2、SDS-PAGE，是鑒定純度最為常用的方法，分辨率高，不需要抗血清，可以從樣品的泳動率初步了解其分子量。還可以和標(biāo)準(zhǔn)樣品相比較，對各電泳區(qū)帶的物質(zhì)加以定型。

3、雙向瓊脂擴(kuò)散法，是鑒定抗原純度最為簡單的方法，主要是通過各種特異性抗血清鑒定抗原純度，首先必須有抗體才能用這一方法。

五、免疫佐劑

1 佐劑的概念和種類

佐劑的概念：佐劑是非特異性的免疫增強(qiáng)劑，有些物質(zhì)與抗原一起或預(yù)先注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。

佐劑的種類

1）微生物及其產(chǎn)物：如分枝桿菌（結(jié)核桿菌、卡介苗) 短小棒狀桿菌、白日咳桿菌、革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素。

2）無機(jī)化合物：氫氧化鋁、明礬等

3）合成佐劑：如雙鏈多聚肌胞苷酸（polyI:C)

4）油劑：如弗氏佐劑、礦物油、植物油

2 佐劑的生物學(xué)作用

增加抗原的免疫原性，使無或微弱免疫原物質(zhì)變成有效的免疫原；提高抗體的滴度，提高初次免疫應(yīng)答和再次免疫應(yīng)答抗體的滴度；改變抗體的類型，由產(chǎn)生IgM 轉(zhuǎn)變成IgG；引起或增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

3 佐劑的作用機(jī)制

① 改變抗原物理性狀，延緩抗原降解和排除，延長體內(nèi)存留的時間，從而更有效的刺激免疫系統(tǒng)；

② 刺激單核巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其對抗原的處理和遞呈能力；

③ 刺激淋巴細(xì)胞增生和分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。

4 弗氏佐劑

弗氏不完全佐劑（IFA) 石蠟油+羊毛脂

弗氏完全佐劑 (CFA) 石蠟油+羊毛脂+ 卡介苗

抗原和佐劑的比例為 1：1，由于佐劑是油劑，加抗原后要充分混合成乳劑。

六、動物的選擇

1 動物的種類和種系：供免疫用的動物主要是哺乳動物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動物的免疫應(yīng)答受動物的遺傳基因影響，同一種系的動物對不同抗原的免疫應(yīng)答和不同種系的動物對同一抗原的免疫應(yīng)答均不盡相同?？乖膩碓磁c免疫動物的親緣較遠(yuǎn)，產(chǎn)生的抗體效價高，同種系或親緣較近，產(chǎn)生的抗體的效價就差。

2 動物的生理狀況：由于個體差異的存在，同一抗原免疫同一種系不同個體的動物，產(chǎn)生的抗體的效價有很大的差異。與動物的年齡和營養(yǎng)狀況密切相關(guān)。免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物，雌性動物特別是妊娠動物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時甚至不產(chǎn)生抗體。

3 抗血清的需要量：根據(jù)實驗中抗血清的需要量，選用最經(jīng)濟(jì)的動物和免疫動物的只數(shù)。一般實驗室采用的抗體，多用兔和羊制備。

七、動物的免疫

1 抗原劑量：抗原的免疫劑量應(yīng)根據(jù)抗原的免疫原性強(qiáng)弱、抗原來源難易、動物的種類、免疫周期等來選擇抗原劑量。

免疫劑量過低，不能引起足夠強(qiáng)的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。蛋白質(zhì)抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般情況下，小鼠的首次免疫劑量為50μg～400μg/次，大鼠為100μg～1 000μg／次，家兔為500μg～1 000μg/kg/次，加強(qiáng)劑量為首次劑量的1／2～1／3。

2 注射途徑：抗原的進(jìn)入途徑?jīng)Q定了抗原吸收、分布和代謝的速度。吸收越快，分解代謝越快，對機(jī)體影響的時間越短。吸收越快，單位時間的有效抗原量就越大，機(jī)體的免疫應(yīng)答就越強(qiáng)，毒副作用也越強(qiáng)。根據(jù)免疫應(yīng)答過程中各階段的特點(diǎn)，選擇注射途徑。常用的途徑有：靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、掌內(nèi)、跖內(nèi)皮下。對抗原吸收的速度：靜脈=脾臟=淋巴結(jié)>腹腔>肌肉>皮下>皮內(nèi)>掌內(nèi)=跖內(nèi)皮下?；A(chǔ)免疫應(yīng)選擇緩慢吸收的途徑，延長抗原刺激時間。

3 加強(qiáng)免疫時間：與抗原的理化性質(zhì)、劑量、進(jìn)入途徑、機(jī)體狀況和所處的免疫應(yīng)答階段有關(guān)。抗原理化性質(zhì)穩(wěn)定，吸收分布速度慢或機(jī)體處于免疫應(yīng)答的早期，應(yīng)延長間隔時間。兩次注射的間隔時間應(yīng)長短適宜,太短起不到再次反應(yīng)的效果，太長則失去了前一次激發(fā)的敏感作用。一般情況下，第一次加強(qiáng)免疫應(yīng)在基礎(chǔ)免疫后的2~3 周，以后每7~10 天加強(qiáng)一次。加佐劑間隔時間應(yīng)為2 周左右。注射的Ig 純度高，則一般不易引起過敏反應(yīng)，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時，極易引起過敏反應(yīng)，所以一定要采取措施。

4 加強(qiáng)免疫次數(shù)：抗原的免疫原性強(qiáng)弱和動物對抗原的敏感性有關(guān)?？乖庖咴匀酰瓒啻渭訌?qiáng)才能獲滿意的抗血清。得制備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法需要獲得高效價的抗血清，宜采用大劑。量長程免疫法。免疫周期長者，可少量多次。免疫周期短者，應(yīng)大量少次。最簡單的方法是直接檢測血清中的抗體滴度，觀察免疫效果。

5 佐劑應(yīng)用：加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對家兔而言，采用弗氏完全佐劑，則需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐劑則注射劑量應(yīng)大10 倍以上。

八、多克隆抗體制備方法

1 多克隆抗體制備方法流程

純化的抗原→與弗氏佐劑一起充分乳化→注射動物體內(nèi)（劑量，次數(shù)，途經(jīng)等均要適宜）→測定效價（如效價高，則不必加強(qiáng)免疫） → 1 周后經(jīng)動脈放血→分離血清→純化抗血清備用。

九、抗血清效價及純度鑒定

抗血清效價：指抗血清中抗體含量的某一相應(yīng)的近似值。

抗血清純度：指只與相應(yīng)的抗原產(chǎn)生沉淀線，而不與其它血清學(xué)無關(guān)的抗原物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)?？寡逍r鑒定方法：雙向免疫擴(kuò)散試驗、凝集反應(yīng)。結(jié)果判定：根據(jù)出現(xiàn)沉淀線的數(shù)量和位置來鑒定免疫血清的純度和效價。

十、抗血清的純化和保存

由抗原免疫動物制得的多克隆抗血清是一個非常復(fù)雜的復(fù)合體。包括了全部血清成分。對于一些試驗來說，免疫血清無需純化即可應(yīng)用，如用于FACS 分析，大多數(shù)ELISA，以及細(xì)胞毒試驗等。有些試驗則要求應(yīng)用進(jìn)一步純化的抗體，如需要精確知道抗體濃度時進(jìn)行化學(xué)修飾標(biāo)記熒光素時或放射物時，以及制備抗體片段（F（ab’）2，Fab 等）時?？贵w存在于抗血清中時，其活性相對穩(wěn)定。每一次的純化過程都會使抗體的活性和絕對量損失。因此抗體的純化要根據(jù)實驗需要進(jìn)行，盡量減少不必要的純化過程。主要純化方法：中性鹽沉淀法、凝膠過濾層析法、離子交換劑層析法、免疫吸附親和層析法。

免疫血清的保存：制備的抗血清如果保存得當(dāng)，可數(shù)月至數(shù)年效價無明顯變化。常用的保存方法：⑴ 冰凍保存； ⑵ 冷凍干燥保存； ⑶ 加防腐劑保存； ⑷ 中性甘油保存；

⑸ 除菌保存。