海藻糖對(duì)植酸酶熱穩(wěn)定性的影響研究

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　　海藻糖（Trehalose）又名繭蜜糖、蘑菇糖、漏蘆糖或簟糖，是在動(dòng)物、植物、微生物中廣泛分布的一種低聚糖，當(dāng)生物處于逆境時(shí)，其含量增加，是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物。海藻糖由兩分子的吡喃葡萄糖單體以α－1，1－糖苷鍵連接而成，其化學(xué)名為α－D－吡喃葡萄糖基-α-D－吡喃葡萄糖苷，分子式為C12H12O11，相對(duì)分子量為378.33（含兩分子結(jié)晶水），熔點(diǎn)為97 ℃，加熱會(huì)失去結(jié)晶水。由于其分子結(jié)構(gòu)對(duì)稱，無(wú)半縮醛基，所以既無(wú)還原性，也無(wú)變旋光性。海藻糖除了具有低聚糖的一般特性（低熱值、抗齲齒性、非消化性、有膳食纖維的作用、有利于雙歧桿菌的增殖）外，還有其獨(dú)特的物理化學(xué)特性，甜度為蔗糖的45％；耐熱耐酸，是二糖中最穩(wěn)定的。既使與氨基酸、蛋白質(zhì)等混合加熱也不會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，一般的酶不能將其水解。海藻糖具有很好的防腐性，對(duì)逆境具有高抗性，許多含海藻糖的動(dòng)植物完全干燥后仍維持其活性，一旦遇水后，立即復(fù)活。海藻糖的生物保護(hù)機(jī)制一般認(rèn)為是其生物保護(hù)機(jī)構(gòu)能強(qiáng)力地束縛水分子，與脂膜質(zhì)共同擁有結(jié)合水或海藻糖本身起到代替膜結(jié)合水的作用，從而防止蛋白膜的變性。由于其具有抗逆、抗寒、抗旱、耐高溫、吸水、低甜度、保濕、生物保護(hù)等特點(diǎn)，使得他在食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面有很大的應(yīng)用前景，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

　　植酸酶是一種能水解植酸的酶類,具有很多生理功能,飼料中添加植酸酶,可以提高磷的利用率,保護(hù)環(huán)境,植酸酶在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用已基本得到肯定。目前植酸酶雖然廣泛應(yīng)用,但在制粒過(guò)程中酶活的喪失或下降始終是制約它應(yīng)用的一個(gè)問(wèn)題,在制粒高溫(75~95 ℃)過(guò)程中,植酸酶的活性將會(huì)大幅降低。目前已對(duì)生物提取的植酸酶進(jìn)行了包被,加入了一些化學(xué)物質(zhì),提高了其高溫條件下的穩(wěn)定性,其中海藻糖已經(jīng)被作為一種包被成分在商品植酸酶中使用,本試驗(yàn)選用海藻糖和商品植酸酶為材料來(lái)研究海藻糖對(duì)商品植酸酶的耐高溫的影響。

　　1　材料與方法1.1　主要設(shè)備儀器恒溫水浴鍋：（37±0.1） ℃；分光光度計(jì)(有10 mm比色皿，可在415 nm下測(cè)定吸光度)；EMS－9A型磁力攪拌器；PHS－3C型酸度計(jì)（可精確至小數(shù)點(diǎn)后兩位）；電爐子、電子秤、移液管、移液槍(1、5 ml)、試管（5、10、20 ml）、燒杯（5、10 ml） 、量筒、溫度計(jì)（1~100 ℃）等。

　　1.2　主要試劑及配制方法商品用植酸酶(黃褐色小顆粒,活性為5 000 U/g);植酸鈉、海藻糖均購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

　　乙酸緩沖液：稱取30 g三水合乙酸鈉和0.126 g無(wú)水氯化鈣，溶解在約500 ml蒸餾水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.5，定容至1 000 ml，保存期1周。

　　植酸鈉溶液(7.5 mmol/l)：稱取0.693 g肌醇六磷酸鈉(Sigma公司生產(chǎn))于100 ml容量瓶中,用乙酸緩沖液溶解并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　硝酸溶液：量取100 ml濃度為65%的濃硝酸與200 ml蒸餾水混合。

　　鉬酸銨試劑：稱取100 g鉬酸銨(天津市化學(xué)試劑四廠生產(chǎn)),溶解在800 ml蒸餾水，再加入10 ml 25%的氨水，定容至1 000 ml，儲(chǔ)存于暗處。

　　釩酸銨試劑：稱取0.235 g釩酸銨，溶解在70 ml水中，預(yù)熱至55 ℃，加入2 ml稀硝酸，定容至100 ml儲(chǔ)存于暗處。避光條件下保存1周有效。

　　顏色終止液：移取2份硝酸溶液、1份鉬酸銨溶液，1份釩酸銨溶液混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　基準(zhǔn)物（磷酸二氫鉀，購(gòu)自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），各種常用玻璃器皿（需不含磷）。

　　1.3　試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.3.1　酶樣試劑的準(zhǔn)備精確稱取1 g植酸酶(精確到0.001 g)、1 g植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中,加入約70 ml pH值為5.5的乙酸緩沖液，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min，制成懸浮液。將此懸浮液靜置0.5 h，直至上清液完全析出后取上清液待用。每個(gè)樣品做1個(gè)平行樣，逐級(jí)稀釋測(cè)定酶活性。
　　1.3.2　酶樣試劑的稀釋（逐步稀釋）酶液用醋酸緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,控制吸光度 OD值在0.1～0.6,確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度。

　　取上清液1 ml于1號(hào)試管中,加入醋酸緩沖液4 ml,搖勻;取1號(hào)液1 ml于2號(hào)試管中,加入醋酸緩沖液3 ml,搖勻;取2號(hào)液1 ml于試管中,加入醋酸緩沖液2 ml,搖勻。(待反應(yīng)液)具體稀釋步驟如下（見(jiàn)表1）。

　　1.3.3　反應(yīng)步驟每組取4支試管(樣品和樣品空白各設(shè)1個(gè)平行,取其平均值)分別加入1.8 ml醋酸緩沖液,再各加0.2 ml待反應(yīng)液。搖勻，37 ℃預(yù)熱5 min。樣品中加4 ml底物，樣品空白中加4 ml終止液，搖勻。37 ℃水浴反應(yīng)30 min（樣品空白可以不反應(yīng)）后，樣品中加4 ml終止液，空白中加4 ml底物，搖勻，靜置后在415 nm下測(cè)定吸光度OD415。具體反應(yīng)步驟見(jiàn)表2。

　　1.4酶活力測(cè)定

　　1.4.1　測(cè)定方法采用絕對(duì)法（仲裁法）。

　　1.4.2　酶活力單位定義酶活力單位定義：37 ℃，pH值為5.5條件下，每分鐘水解植酸鈉溶液釋放1 μmol無(wú)機(jī)磷的酶量為1個(gè)酶活單位?；钚在d高，單位時(shí)間內(nèi)水解植酸、植酸鹽的量就越多。


　　1.4.3　待測(cè)酶液的制備精確稱取兩份1 g的植酸酶(精確到0.001 g)、1 g的植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中，加入約70 ml pH值為5.5的乙酸緩沖液，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min，制成懸浮液。

　　1.4.4　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取0.680 4 g在105 ℃烘至恒重的基準(zhǔn)物磷酸二氫鉀于100 ml容量瓶中,用乙酸緩沖液溶解,并定容至100 ml,濃度為50.0 mmol/l,再按表3中的比例稀釋成不同濃度,按表2中的步驟與試樣一起反應(yīng)并測(cè)定,以無(wú)機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),列出直線回歸方程(y=ax+b)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)見(jiàn)表3和圖1。

　　1.4.5酶活力計(jì)算

　　將反應(yīng)完的溶液在室溫下靜置10 min達(dá)澄清后在分光光度計(jì)415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白的吸光值和樣品溶液的吸光值。

　　其原理是利用植酸酶水解植酸鹽釋放無(wú)機(jī)磷，通過(guò)加入酸性鉬-釩試劑，使水解反應(yīng)停止，同時(shí)與水解釋放出來(lái)的無(wú)機(jī)磷產(chǎn)生顏色反應(yīng)，形成黃色的釩鉬磷絡(luò)合物，在波長(zhǎng)415 nm下進(jìn)行比色測(cè)定磷的含量。以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液(或標(biāo)準(zhǔn)植酸酶)為參照，計(jì)算酶活力。

　　酶活力計(jì)算公式：U=F×C/30m式中：U——試樣中植酸酶的活性（U/g）；C——根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸方程計(jì)算出的磷濃度；F——試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；m——試樣質(zhì)量（g）；30——反應(yīng)時(shí)間（min）。

　　以相應(yīng)不加熱的酶活力作對(duì)照(100％)，測(cè)定植酸酶活力保留率。

　　酶活力保留率(％)=(加熱后酶活/不加熱的原酶活性)×100%=(85 ℃后反應(yīng)得到的OD415/不加熱原酶樣反應(yīng)后得到的OD415)×100%以不加海藻糖的酶活力保留率為對(duì)比，比較海藻糖對(duì)植酸酶熱穩(wěn)定性的影響。根據(jù)公式計(jì)算酶活力。

　　2 數(shù)據(jù)計(jì)算與結(jié)果分析
　　2.1 數(shù)據(jù)計(jì)算（見(jiàn)表4）C1=(0.170-0.035)/0.035=3.857，U1=6 000×3.857/30=771.4；C2=(0.058-0.035)/0.035=0.657，U2=6 000×0.657/30=131.4；C3=(0.103-0.035)/0.035=1.943，U3=6 000×1.943/30=388.6；C4=(0.112-0.035)/0.035=2.2，U4=6 000×2.2/30=440;C5=(0.126-0.035)/0.035=2.6，U5=6 000×2.6/30=520。

　　酶活保留率U'2=(U2/U1)×100%=(131.4/771.4)×100=17.1%；酶活保留率U'3=(U3/U1)×100%=(388.6/771.4)×100=53.4%；酶活保留率U'4=（U4/U1）×100%=（440/771.4）×100=57.1%；酶活保留率U'5=（U5/U1）×100%=（520/771.4）×100=67.4%。

　　2.2 結(jié)果分析

　　添加不同量的海藻糖對(duì)植酸酶熱穩(wěn)定性的影響(見(jiàn)圖2)

　　從圖2可見(jiàn)，植酸酶溶液中加入等體積的海藻糖溶液,85 ℃處理5 min后均能提高在高溫下的熱穩(wěn)定性，加入40、60和80 mg海藻糖的植酸酶其酶活保留率分別達(dá)到了53.4%、57.1%和67.4%，較原酶活保留率17.1%分別提高了36.3、40、50.3個(gè)百分點(diǎn)。添加80 mg海藻糖對(duì)植酸酶的熱穩(wěn)定性提高效果最好。

　　3 討論

　　3.1 研究進(jìn)展酶的穩(wěn)定性一直是困擾其大規(guī)模應(yīng)用的主要原因。為了保持酶的活力，國(guó)內(nèi)外大多采用在濃縮液中加入金屬離子、多元醇、多糖類化合物等方法。海藻糖作為一種多醇化合物，既可通過(guò)氫健與酶蛋白表面分子相連結(jié)，也能通過(guò)氫健有效地與外部水分子相連結(jié)，使酶蛋白分子穩(wěn)定。本試驗(yàn)在植酸酶中加入不同質(zhì)量的海藻糖均能提高商品植酸酶在高溫下的熱穩(wěn)定性，其中以80 mg海藻糖的效果最好。其在生產(chǎn)中的應(yīng)用如何尚需作進(jìn)一步的研究。

　　隨著基因工程與蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，定點(diǎn)突變、同序方法和定向進(jìn)化技術(shù)將逐漸應(yīng)用于酶的熱穩(wěn)定性研究。在分子水平上對(duì)植酸酶基因進(jìn)行改造，使植酸酶本身就具有良好的熱穩(wěn)定性無(wú)疑是很有意義的。


　　3.2 影響試驗(yàn)效果的其它因素

　　在試驗(yàn)過(guò)程中由于試驗(yàn)條件和試驗(yàn)環(huán)境的限制，試驗(yàn)結(jié)果受諸多因素的影響，其影響因素除了pH值、溫度、濕度、作用時(shí)間、抑制劑、激活劑、底物和產(chǎn)物濃度，以及植酸、植酸酶來(lái)源等外，還表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:① 植酸酶的活性會(huì)因放置時(shí)間的加長(zhǎng)而使其活性降低，故其酶活力保留率也會(huì)隨之降低。② 試驗(yàn)水浴溫度不太穩(wěn)定時(shí)有變化，從而使試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。

　　4 結(jié)論

　　本試驗(yàn)采用絕對(duì)法對(duì)不同濃度的海藻糖對(duì)植酸酶熱穩(wěn)定性的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明添加80 mg海藻糖對(duì)植酸酶的熱穩(wěn)定性提高效果最好，酶活力保留率提高了50.3個(gè)百分點(diǎn)。在植酸酶液中加入海藻糖比不加時(shí)酶活力保留率提高36.3~50.3個(gè)百分點(diǎn)。

　　（參考文獻(xiàn)20篇，刊略，需者可函索）（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）李融，天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，300384，天津。

　　蘇琰(通訊作者)，揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。

asiazhang1980

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