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wy0351

請教大家，幫我看看為什么我5000U的植酸酶測出來總是2000多一些，我用的挑戰(zhàn)的植酸酶。

1、溶液配制：

1.1.乙酸緩沖液(1)：稱取20.52g無水乙酸鈉于1000 ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個月有效。

1.2.乙酸緩沖液(2)：稱取20.52g無水乙酸鈉，0.5 ml TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，室溫下存放2個月有效。

1.3.硝酸溶液：1+2水溶液。

1.4.鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解（微加熱），加入1ml氨水(25％)，用蒸餾水定容至刻度。

1.5.偏釩酸銨溶液：稱取0.235 g偏釩酸銨于100mL棕色容量瓶中，加50ml蒸餾水微加熱溶解，待溶液冷卻后加入2 mL硝酸溶液(1.3)，用蒸餾水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。

1.6.顯色終止液：移取2份硝酸溶液(1.3)，1份鉬酸銨溶液(1.4)，1份偏釩酸銨溶液(1.5)混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.7．植酸鈉溶液：（sigmaP0109）稱取0.69g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(2)溶解并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。


1.8基準物：準確稱取0.6804g在105℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（1）溶解，準確定容至刻度（濃度為50.0µmol/ml）。

2、測定步驟：

2.1.標準曲線：

按下列圖表用乙酸緩沖液(2)稀釋成不同濃度，與待測試樣一起反應(yīng)測定

標準稀釋比例

標液序號	稀釋倍數(shù)	濃度/（µmol/ml）
1	0.5→16	1.5625
2	0.5→8	3.125
3	0.5→4	6.25
4	1→4	12.5
5	1→2	25

2.2.樣品溶液制備：

準確稱取植酸酶試樣1g，置于100ml容量瓶中，加入乙酸緩沖液（2）搖勻并定容至刻度，放入磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌40min，將提取后的試樣在離心機上以4000r/min離心15min，取上清液1ml于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（2）定容至刻度，使樣液濃度保持在0.5U/ml左右，待反應(yīng)。

2.3．反應(yīng)步驟：

取9支刻度試管，按下面順序進行操作，標準空白加0.2ml乙酸緩沖液(2)，

反應(yīng)順序	樣品、標準	樣品空白（標準空白）
1、乙酸緩沖液1（ml）	1.8	1.8
2、待反應(yīng)液（ml）	0.2	0.2
3、混合	√	√
4、37℃水浴預(yù)熱5min	√	√
5、依次加入底物溶液（ml）	4	4（第二步）
6、混合	√	√
7、37℃水浴水解30min	√	√
8、依次加入終止液（ml）	4	4（第一步）
9、混合	√	√

2.4．樣品測定

反應(yīng)后將試樣在常溫下靜置10min，出現(xiàn)渾濁，然后在離心機上以4000r/min離心15min，取上清液以標準空白調(diào)零，在分光光度計波長為415nm處測出各個吸光值。

以吸光值為橫坐標，摩爾量為縱坐標作圖。Y=kx+b

3.計算公式：

    U=yn/0.2mt

U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
y——根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的無機磷的量，（μmol）
n——試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù),10000；
m——試樣質(zhì)量g；
t——反應(yīng)時間min。30min

海上龍卷風(fēng)

不同測定方法下酶活表現(xiàn)不一樣

liyunhuddt

要看你是不是和對方提供的檢驗方法一樣

xyy169

植酸酶是有國標方法的，你這個好像就是國標。
但酶制劑的檢測，不僅只是檢測方法的問題，更要注重的是操作細節(jié)，一個細節(jié)可能就是上幾倍，十幾倍的差距。
注意一下以下幾個方面：1、酶的溶出過程，包括時間，方法；2、緩沖液2中的牛血清白蛋白等是否有加（對有些植酸酶的影響非常大）；3、確定一下反應(yīng)溫度，可另用溫度計測試；4、加底物量是否一致，包括間隔時間等細節(jié)多注意一下。
另外你拿一個你可以檢測到5000單位的標準樣品進行對比檢測，以確定你的操作和儀器是否正確等。

wy0351

回復(fù) xyy169 的帖子

樓上的，您好，我測的是直接的植酸酶，高速磁力攪拌40min，不加熱的。緩沖液2中的牛血清白蛋白，去痛100我也都加了。水浴鍋溫度控制在37.0℃。加底物和終止液都是用的1~5ml量程移液槍加的。唯一一個間隔的時間我沒有太在意。我感覺連續(xù)加，時間不會差多少吧。難道就是這個在影響嗎？

tianfangxu

您好，我也是做酶制劑檢驗的，上次我也做了植酸酶，沒做出來，我把做曲線和做樣的曲線加的緩沖溶液加的搞錯了，我做曲線不是加的緩沖液，我加的蒸餾水。我希望我們可以多多交流酶制劑方面的問題。我最近又在糾結(jié)糖化酶......



補充內(nèi)容：
您稀釋的是10000倍吧，您測的植酸酶活性是多大的？

wy0351

回復(fù) tianfangxu 的帖子

我測的是5000U的植酸酶，稀釋10000倍

wy0351

回復(fù) tianfangxu 的帖子

我前一段做一幾天糖化酶。。。

hxz001

4樓的意見比較客觀

akenuma

我們檢測稀釋800倍