羅非魚無乳鏈球菌病診治

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本文就羅非魚無乳鏈球菌病的流行情況、臨床癥狀、致病機理、診斷方法和防治措施作一簡介，為廣大基層水產(chǎn)工作者和養(yǎng)殖戶對羅非魚無乳鏈球菌病的防控提供借鑒。

文/圖 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心 汪開毓 陳德芳 黃凌遠

汪開毓
四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院院長，博士生導(dǎo)師。四川省學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人，四川省有突出貢獻的優(yōu)秀專家。中國獸藥典委員會委員，農(nóng)業(yè)部新獸藥評審委員會委員，中國動物病理學(xué)會常務(wù)理事，國家重要核心期刊《水產(chǎn)學(xué)報》編委會委員，四川省魚病研究會主任，四川省動物防疫協(xié)會副會長。

主編、副主編和參編《現(xiàn)代禽病診斷與防治全書》、《魚病防治手冊》、《魚病防治與安全用藥》、《養(yǎng)魚全書》、《水生動物病害學(xué)（全國統(tǒng)編教材）》、《新編漁藥手冊》、《動物病理學(xué)》、《獸醫(yī)診療新技術(shù)》、《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥處方大全》、《魚類疾病彩色診療圖譜》和《斑點叉尾鮰疾病彩色診療圖譜》等專著和教材11部。

圖1  羅非魚無乳鏈球菌病表現(xiàn)為（左）角膜發(fā)白渾濁，（右）眼球腫大突出         

   

圖2  雙側(cè)眼球腫大突出

圖3  眼球腫大突出，虹膜充血

   

圖4  革蘭氏染色分離菌株球菌

圖5  電鏡下的無乳鏈球菌

自2009年以來，我國南方多個省市暴發(fā)了羅非魚鏈球菌病，其發(fā)病率高達40%，死亡率接近100%；鏈球菌一度被人喻為羅非魚世界的“H1N1”。在不少養(yǎng)殖地區(qū)經(jīng)?？梢娪捎诩膊”┌l(fā)而傾家蕩產(chǎn)的養(yǎng)殖戶，疾病的發(fā)生嚴重挫傷了養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖積極性，也給當?shù)亓_非魚飼料銷售商、出口商以及漁政部門等相關(guān)利益方帶來極大的困擾；病害也給當?shù)亓_非魚產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

廣大羅非魚養(yǎng)殖戶與行業(yè)行政主管部門都急切呼吁盡快搞清羅非魚鏈球菌病的病原學(xué)特性及其致病機理，同時建立特異性強、靈敏度高的診斷方法，篩選有效的防治藥物，研制安全、高效的新型疫苗等，以降低疾病對羅非魚養(yǎng)殖的危害，促進羅非魚養(yǎng)殖的健康發(fā)展。
本文就羅非魚無乳鏈球菌病的流行情況、臨床癥狀、致病機理、診斷方法和防治措施作一簡介，為廣大基層水產(chǎn)工作者和養(yǎng)殖戶對羅非魚無乳鏈球菌病的防控提供借鑒。

一、病原學(xué)特征

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）亦稱GBS（group B Streptococcus），屬于鏈球菌科（Streptococcace）鏈球菌屬（Streptococcus），為B群鏈球菌，革蘭氏陽性，呈鏈狀或成對排列的球菌。其在自然界中分布廣泛，普遍存在于水，動物體表，泌尿生殖道和乳汁中，對哺乳動物、爬行動物、兩棲動物和魚類均有致病性，是一種人-獸-魚共患病病原。無乳鏈球菌可引起新生兒的敗血癥、肺炎和腦膜炎，奶牛乳腺炎和魚的腦膜炎，給人類的健康帶來威脅，也給家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

無乳鏈球菌菌體為圓形或卵圓形，直徑約為2μm，鏈狀或成對排列，在肉湯內(nèi)對數(shù)生長期，常呈成長鏈排列，無鞭毛，無芽孢，無運動性。無乳鏈球菌為兼性厭氧菌，過氧化氫酶陰性。在血液瓊脂平板上培養(yǎng)18h-24h后，形成淡灰白色、隆起、閃光的小菌落。大多數(shù)無乳鏈球菌菌株在10℃或45℃或pH9.6的條件下不生長，最適溫度為36℃-37℃，最適pH為7.4-7.6。在普通培養(yǎng)基中生長不良，在血液瓊脂培養(yǎng)基，腦心浸液培養(yǎng)基等營養(yǎng)成分較高的培養(yǎng)基中生長良好，能在含40%膽汁的培養(yǎng)基中生長，不能在6.5％NaCl中生長。
大部分無乳鏈球菌菌株呈β-溶血，但也有α-或γ-溶血。能水解馬尿酸鈉，精氨酸，不水解七葉苷，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，只在好氧條件下發(fā)酵甘油，不發(fā)酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、菊糖、甘露醇和山梨醇。

根據(jù)細菌表面莢膜多糖抗原不同將無乳鏈球菌分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ-Ⅸ 10種血清型。其中血清型Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ已被報道是引起人類疾病的主要血清型，血清型Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型是感染魚類的主要血清型。

二、疾病流行情況

近幾年來，全球范圍內(nèi)無乳鏈球菌感染多種海水和淡水養(yǎng)殖魚類并引起暴發(fā)性疾病的報道呈現(xiàn)增加趨勢，尤其在亞洲的羅非魚養(yǎng)殖地區(qū)報道較多，無乳鏈球菌已給亞洲的羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害。中國、泰國、馬來西亞、科威特等國均暴發(fā)了嚴重的羅非魚無乳鏈球菌病，有較高的發(fā)病率和死亡率。

本病在我國南方地區(qū)5-10月的高溫期容易流行，流行水溫25-37℃，發(fā)病率達20%-30%，發(fā)病魚的死亡率可高達60%-100%；水溫降至20℃以下時則發(fā)病較少；在高水溫季節(jié)時，病魚的死亡高峰期可持續(xù)2-3周，在低水溫季節(jié)，病魚呈慢性發(fā)病，死亡率降低，但持續(xù)時間長。疾病主要威脅100g以上的稚魚到1kg左右的成魚；無乳鏈球菌病主要以水平方式傳播，體表有損傷或受環(huán)境應(yīng)激過大的魚易感染發(fā)病。

暴發(fā)無乳鏈球菌病的羅非魚往往伴有其他細菌病如愛德華氏菌、弧菌、嗜水氣單胞菌等的混合感染，加劇羅非魚的死亡。

（未完待續(xù)...）

（本文摘自《水產(chǎn)前沿》雜志8月刊，了解更多，請登錄“中國水產(chǎn)頻道”，http://www.fishfirst.cn/）

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三、疾病臨床癥狀

感染無乳鏈球菌的羅非魚表現(xiàn)為全身性的充血、出血伴有嚴重的炎性反應(yīng)。病魚表現(xiàn)為食欲減退，游動不穩(wěn)定呈螺旋狀，水面驚嚇無反應(yīng)呈昏睡狀，有的停滯在水面，有的身體彎曲。病程較長的羅非魚表現(xiàn)為角膜發(fā)白渾濁、眼球腫大突出，虹膜充血,嚴重的可見眼球脫落，由于羅非魚感染無乳鏈球菌時眼球腫大突出的現(xiàn)象多見，具有一定的示病性，因此養(yǎng)殖戶多稱此病為“突眼”癥。

下頜、鰓蓋邊緣、鰭條基部不同程度的充血、出血；慢性感染往往出現(xiàn)體表膿腫，尤其是在下頜骨或鰭條基部的位置可見2-3毫米大小的膿腫，尾部可見10-20厘米的大膿腫。急性感染伴有腹水、肛門紅腫、外突的現(xiàn)象。解剖可見胃腸道內(nèi)空無食物，肝臟腫大充血，顏色不均，質(zhì)地脆弱，膽囊充盈、充滿藍黑色的膽汁。腦膜充血明顯，腸道有輕度的充血和炎癥，腸腔內(nèi)有少量黃色的粘液。

進一步的組織病理學(xué)觀察顯示發(fā)病羅非魚肝臟肝細胞呈顆粒變性、腫脹，局部灶性壞死，壞死灶內(nèi)肝細胞核濃縮、細胞核破裂，甚至有一定區(qū)域呈現(xiàn)細胞崩解形成均質(zhì)紅染的無結(jié)構(gòu)物質(zhì)，并有多量炎癥細胞浸潤。腦嚴重水腫，腦基質(zhì)出現(xiàn)大量間隙，呈海綿狀，神經(jīng)細胞腫脹、變性，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增多，血管周圍間隙明顯增寬。腸腔中充斥大量的脫落的上皮細胞、炎性白細胞和均質(zhì)紅染蛋白性滲出物，固有膜血管充血，有大量炎癥細胞浸潤。眼底部淤血嚴重，水腫，細胞間隙明顯增寬，大量巨噬細胞和嗜中性粒細胞浸潤，部分細胞壞死，其胞核固縮或碎裂。

四、致病機理

羅非魚是無乳鏈球菌高度敏感的宿主。病原菌如何通過黏膜和組織屏障而侵入血液循環(huán)，早期研究提示單核細胞攜帶細菌或通過其他機制進行散播，如細胞噬菌作用。此外，莢膜多糖（CPS）在鏈球菌中具有抗吞噬作用，因此，細胞外鏈球菌能在血液中自由傳播。同時，鏈球菌對吞噬細胞有一種相對較高的粘附作用，而不是被吞噬，細菌能大量地粘附在巨噬細胞上不被其消化，這可能是持續(xù)的菌血癥和散布菌源的原因。

鏈球菌對腦微脈管內(nèi)皮細胞（BMEC）的粘附作用以及細菌分泌出毒性因子作用于內(nèi)皮細胞可能對鏈球菌能穿越血腦屏障（BBB）有重要有作用。Klesius和Evans等人研究了無乳鏈球菌胞外產(chǎn)物（ECP）對尼羅羅非魚巨噬細胞的趨化活性，表明無乳鏈球菌的胞外產(chǎn)物能夠引起巨噬細胞的趨化現(xiàn)象和化學(xué)增活現(xiàn)象，并認為進一步研究無乳鏈球菌胞外產(chǎn)物與巨噬細胞的特異性反應(yīng)，以及這種反應(yīng)是如何引起巨噬細胞游走，吞噬和殺菌力作用，將有助于對無乳鏈球菌發(fā)病機理的研究。

目前報道最多的無乳鏈球菌毒力因子主要有莢膜多糖，胞外毒素和CAMP因子等。莢膜多糖作為該菌關(guān)鍵的毒力因子，經(jīng)唾液酸修飾后可鈍化宿主旁路補體激活途徑進而產(chǎn)生致病作用。無乳鏈球菌可以產(chǎn)生外毒素，其中β-溶血素，具有溶血性和動物致死性等，可直接破壞宿主組織的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致靶器官的功能紊亂，加之紅細胞被外毒素大量破壞，機體最終衰竭死亡。有報道稱CAMP因子是無乳鏈球菌的主要毒力因子。另外，C蛋白β抗原以及無乳鏈球菌發(fā)酵葡萄糖代謝產(chǎn)生的乳酸也可能是無乳鏈球菌的毒力因子。

五、診斷方法

魚類生活在復(fù)雜的水環(huán)境中，水體中存在大量的條件病原體，疾病的發(fā)生早期可能是單因素所致，病程越長繼發(fā)多種病原感染的可能越大，如感染鏈球菌的病魚，由于體質(zhì)嚴重下降容易繼發(fā)氣單胞菌等條件致病菌感染；而寄生蟲病導(dǎo)致的體表破潰性創(chuàng)傷，又容易繼發(fā)細菌病和真菌病的發(fā)生；因此在疾病診斷時要考慮多病原聯(lián)合感染的可能，綜合的考慮多種因素（包括飼料變質(zhì)、養(yǎng)殖密度過大等非生物因素）才能做到疾病的快速準確診斷。

此外，魚病的發(fā)生發(fā)展是個復(fù)雜的過程，存在“多因一癥”的現(xiàn)象，如彩虹病毒病、鏈球菌、假單胞菌和愛德華氏菌等多個細菌性疾病都可能觀察到羅非魚眼球的充血、白濁和凸出的現(xiàn)象；長期使用同一種飼料導(dǎo)致魚體營養(yǎng)不全或某種營養(yǎng)素缺乏，病魚也可以觀察到“突眼”癥。因此，對于羅非魚無乳鏈球菌病的快速準確診斷還得需要借助微生物學(xué)方法、血清學(xué)方法或分子生物學(xué)方法。近年來，農(nóng)業(yè)部在水產(chǎn)養(yǎng)殖的重點縣市構(gòu)建了水生動物病害診斷實驗室，為基層病害的快速診斷提供條件，基層養(yǎng)殖戶在進行疾病的診斷時，可求助于當?shù)氐臐O政機構(gòu)或科研院所。

對于羅非魚無乳鏈球菌病的確診可以結(jié)合臨床癥狀、病原檢測和分子快診技術(shù)：1、觀察發(fā)病魚是否具有如嗜睡打轉(zhuǎn)、眼球突出或渾濁發(fā)白、腦膜炎、內(nèi)臟器官及體表出血等典型病理變化；2、采集發(fā)病魚的組織，制備組織觸片進行吉姆薩染色，借助光學(xué)顯微鏡油鏡觀察是否存在成雙或成鏈狀的球性細菌；3、在無菌條件下，從發(fā)病魚的組織中是否分離到致病性鏈球菌，有條件的可采用生化方法、免疫學(xué)方法或分子生物學(xué)方法對分離細菌進行準確鑒定來確診。

目前鏈球菌的商用鑒定系統(tǒng)有RAPID Strep Strip，Viteck system，API 20 STREP和ATB Expression，這些商用鑒定系統(tǒng)使用方便，準確可靠。本實驗室以無乳鏈球菌的具有高度保守性的莢膜多糖基因和CAMP因子基因為檢測序列，成功建立了快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的PCR方法，這個方法具有簡便、快速、靈敏、準確和特異性等優(yōu)點。

六、防治措施

對于羅非魚無乳鏈球菌病的防治強調(diào)“防重于治”，可以從改善和優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境、提高飼料質(zhì)量、增強魚體自身抵抗力、切斷病源傳播途徑和科學(xué)使用疫苗等方面進行羅非魚疾病的綜合防治，除了做好平時的養(yǎng)殖管理外，最好把使用疫苗作為本病預(yù)防的重要方法，甚至可提高到首選方法的地位。

在藥物防治方面，尤其是平時預(yù)防時，我們建議以下用藥原則：能不用藥則不用，必須用則少用；盡量使用中草藥而不是用化學(xué)藥物，一旦使用化學(xué)藥物，必須使用制劑，不使用原藥，嚴格遵守休藥期。

與此同時，需要提醒各養(yǎng)殖戶的是，許多魚類的病原體也是可以感染人類的，如無乳鏈球菌都能引起人類的組織感染，尤其是手上有傷口且體質(zhì)較弱的人員較易感染。

改善水體水質(zhì)

水環(huán)境是魚類賴以生存的必要條件，水質(zhì)的好壞直接決定著羅非魚能否健康、快速的生長。盲目擴大魚類的養(yǎng)殖密度、強化投餌量都會加重水體的負擔(dān)，破壞原有的生態(tài)平衡。

研究證實高密度放養(yǎng)情況下會增加疾病的發(fā)生概率，這是由于密度過大魚類的抗應(yīng)激能力下降，加之魚類代謝產(chǎn)物增多若換水不足，水中溶氧過低易引起水質(zhì)惡化，使池中亞硝酸鹽濃度上升，乃至中毒，并導(dǎo)致魚體抵抗力下降，從而導(dǎo)致細菌繼發(fā)性感染如鏈球菌和嗜水氣單胞菌的感染。因此養(yǎng)殖密度不宜過大。

此外，通過改變生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成來控制某些細菌的過度繁殖，或者使用合理劑量的消毒劑來抑制病原菌的增生是可行的，當然如果在高溫季節(jié)能有辦法降低養(yǎng)殖水溫也是非常關(guān)鍵的防病措施，可惜到現(xiàn)在為止我們還沒有辦法做到。

免疫增強劑

不少研究表明在魚餌料中添加一些免疫增強劑可以明顯提高羅非魚的免疫力和抗病能力，如全雄奧尼羅非魚飼料中?-葡聚糖添加量在1.0%-1.5%時，可以明顯改善其生長性能和抗嗜水氣單胞菌感染的能力；黃芪多糖能夠增加羅非魚的免疫功能，有抗菌、抗病毒，解毒，抗炎，抗應(yīng)激等功能；松籽多糖對奧尼羅非魚有免疫調(diào)節(jié)作用和較強的抗氧化作用；云芝多糖能夠提高奧尼羅非魚經(jīng)嗜水氣單胞菌攻毒后的存活率。

此外，酵母多糖、維生素C和維生素E等均有提高魚體免疫力的作用，復(fù)合微生態(tài)制劑加入奧尼羅非魚的基礎(chǔ)飼料中也被證實能提高奧尼羅非魚的抗病力。因此，在魚類餌料中適當加入免疫增強劑可以有效提高魚體抗病能力。

疫苗

免疫接種是一種相對健康安全的疾病預(yù)防措施，雖然魚類的特異性免疫機制還很不完善，但國內(nèi)外研究已證實魚類免疫疫苗對魚體能夠產(chǎn)生免疫保護力。目前羅非魚上研究最多的是鏈球菌疫苗。國外從上世紀九十年代中期便開始進行魚鏈球菌疫苗的研究：以色列在1995-1997年間研制的海豚鏈球菌滅活疫苗使虹鱒的鏈球菌病死亡率從50%下降到5%。美國也于1999年開始著手研制海豚鏈球菌滅活疫苗，并在羅非魚免疫保護實驗中，產(chǎn)生較好的保護效果，相對保護率高達93.2%。

2009年以來本實驗室與通威股份有限公司合作在羅非魚無乳鏈球菌的疫苗研究上開展一些工作并取得了一定成績，研制的注射和口服免疫疫苗實驗室免疫保護率分別可達80%和60%。在各方面的不斷努力下，國內(nèi)商品化漁用疫苗的出現(xiàn)指日可待。

中草藥治療

中草藥作為天然藥物，憑借其無公害、無耐藥性、作用廣泛等特點受到人們的青睞。中草藥在防治魚類寄生蟲病、細菌病和病毒病上發(fā)揮著積極的作用。但是由于中草藥中有效成分含量較低且用藥量大，制劑成本較高，相關(guān)的水生動物藥效和藥動研究基礎(chǔ)匱乏等原因，使得中草藥在生產(chǎn)上的應(yīng)用受限。

Pongsak和Parichat研究了大蒜、穿心蓮、對葉豆、山竺、番石榴和鵲腎樹六種草藥對尼羅羅非魚無乳鏈球菌感染的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)這六種草藥對無乳鏈球菌均有不同程度的抗菌作用。

化學(xué)藥物治療

化學(xué)藥物治療疾病是最直接和簡便的措施手段，但長期使用或使用不當就難免使病原體產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致防治失敗，不僅破壞了養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境，而且存在的藥物殘留也會危及人類健康。對于有條件的養(yǎng)殖場，可以通過了解并掌握養(yǎng)殖場內(nèi)病原菌耐藥狀況的變化，來篩選有效地疾病預(yù)防和治療用藥物。

在藥物的使用劑量上，并非“猛藥能治病”，超劑量的使用藥物不僅不能有效地控制疾病，而且藥物無論對養(yǎng)殖水體還是對動物的危害都是很大的。因此，嚴格按照水產(chǎn)用獸藥說明書上規(guī)定的劑量使用，是獲得良好療效的前提。

本實驗室對2009年海南多地羅非魚源無乳鏈球菌進行了藥敏檢測結(jié)果顯示，消毒藥中戊二醛、戊二醛癸甲溴銨合劑、聚維酮碘的效果較好；以K-B瓊脂擴散法對各分離株進行藥敏測試，結(jié)果顯示不同來源的菌株藥敏結(jié)果差異大，檢測的16種藥物中，僅第二代頭孢類藥物美福仙對各菌株具有敏感殺菌作用，其次是強力霉素和四環(huán)素，其它藥物對各分離株呈現(xiàn)不同的敏感度，藥物防治存在難度，各分離株藥敏結(jié)果見表1。

因而建議用藥：1、鹽酸強力霉素，每天每千克魚用藥20-50mg，制成藥餌，連續(xù)投喂5-7d；2、四環(huán)素，每天每千克魚用藥75-100mg，制成藥餌，連續(xù)投喂10-14d；3、有條件的養(yǎng)殖場，可以進行藥敏試驗結(jié)果篩選用藥。



（本文摘自《水產(chǎn)前沿》雜志8月刊，了解更多，請登錄“中國水產(chǎn)頻道”，http://www.fishfirst.cn/）