解析豬瘟免疫失敗的主要原因

畜牧人編輯部3 · 發(fā)表于 2013-7-12 09:24:47

豬瘟是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一。OIE 制定的《國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典》( 2002 年版) 仍將其列為 A 類法定報(bào)告?zhèn)魅静≈弧W美等發(fā)達(dá)國(guó)家通過疫苗免疫、撲殺等綜合防制技術(shù)措施已消滅了豬瘟。在我國(guó)五十年代中國(guó)獸藥監(jiān)察所方世杰、周泰沖、李繼庚等選育了一株適應(yīng)家兔后對(duì)豬基本無毒力, 但卻保持良好免疫原性的弱毒疫苗株——中國(guó)兔化弱毒疫苗株, 國(guó)外稱為 C 株, 同時(shí)建立了凍干技術(shù)。因其具有免疫力強(qiáng)、保護(hù)率高且持久、遺傳穩(wěn)定、無殘余毒力等優(yōu)點(diǎn), 是國(guó)際上公認(rèn)的效果最好的豬瘟弱毒疫苗, 由此獲得國(guó)家發(fā)明一等獎(jiǎng), 該研究曾為我國(guó)乃至世界許多國(guó)家豬瘟的防制起到了關(guān)鍵的作用。

但是近 20 年來, 我國(guó)豬瘟的流行形式和發(fā)病特點(diǎn)已經(jīng)發(fā)生了很大的變化, 尤其是妊娠母豬帶毒綜合征、仔豬胎盤垂直傳播及先天免疫耐受, 同時(shí)還存在其他多種非典型的發(fā)病特點(diǎn)。在出現(xiàn)這些現(xiàn)象的地區(qū)和豬場(chǎng)往往同時(shí)表現(xiàn)無法解釋的免疫失敗, 對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)出現(xiàn)的這個(gè)重大問題和難點(diǎn)問題, 國(guó)家已投入相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行研究, 并取得了一些較新的研究進(jìn)展, 綜述如下。

1、豬瘟持續(xù)感染對(duì)疫苗免疫的影響

1. 1　母豬持續(xù)感染與垂直傳播　母豬持續(xù)感染和仔豬胎盤感染是目前引起免疫失敗的重要原因。我們首次在實(shí)驗(yàn)室成功地利用豬瘟野毒人工復(fù)制了豬瘟病毒持續(xù)感染的帶毒母豬動(dòng)物模型, 此母豬可帶毒 750天。這種豬甚至可以終生帶毒、排毒, 可成為豬瘟病毒的主要儲(chǔ)存宿主, 血液中的含毒量可達(dá)105～106PF U/ m l。最早報(bào)道豬瘟胎盤感染是在 1955年, 以后此類報(bào)道逐漸增多。胎盤感染后, 引起母豬繁殖障礙,出現(xiàn)弱胎、死胎, 甚至木乃伊胎, 從死亡仔豬體內(nèi)可分離到豬瘟病毒。為了研究持續(xù)感染母豬對(duì)仔豬的胎盤垂直傳播情況, 再將這頭母豬與人工感染另一株豬瘟野毒的帶毒公豬或健康公豬自然交配或人工受精使其懷孕產(chǎn)仔, 可產(chǎn)下帶毒的木乃伊胎和死胎,用豬瘟熒光抗體檢測(cè)胎豬均為陽(yáng)性, 此后該母豬不能再次配種。為了解帶毒母豬對(duì)同居豬和環(huán)境的污染情況, 在母豬帶毒 273 天時(shí), 用健康陰性豬與之同居, 可造成同居豬感染。至此成功地人工復(fù)制了豬瘟病毒胎盤垂直傳播及水平傳播的動(dòng)物模型,在實(shí)際工作中, 這些持續(xù)感染帶毒豬的存在, 可形成豬瘟常發(fā)地區(qū)和豬瘟常發(fā)豬場(chǎng)。由這種母豬產(chǎn)下的仔豬多為先天免疫耐受豬, 這種情況常常導(dǎo)致豬瘟在豬場(chǎng)形成惡性循環(huán), 即豬瘟亞臨床感染→胎盤感染→母豬繁殖障礙→仔豬帶毒→后備母豬→亞臨床感染。如此惡性循環(huán), 使得帶毒豬在臨床中有 3% ～33%的帶毒率。

1. 2　仔豬先天免疫耐受　由母豬持續(xù)感染和仔豬胎盤感染引起的免疫失敗現(xiàn)象, 除了出現(xiàn)上述生產(chǎn)水平降低的情況外, 經(jīng)胎盤感染出生后存活的仔豬往往成為持續(xù)感染者, 可長(zhǎng)期帶毒、排毒, 其本身并不表現(xiàn)臨床癥狀。這種豬除了對(duì)豬場(chǎng)造成惡性循環(huán)外, 這種經(jīng)胎盤感染的仔豬出生后, 吸允初乳, 數(shù)日內(nèi)病毒血癥可一過性降低, 但病毒存在于全身上皮組織、淋巴樣組織和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織, 這種感染豬不能建立中和性抗體應(yīng)答, 形成免疫耐受, 以至于對(duì)疫苗免疫后不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。L iess用低毒力的野毒Glento rf株給妊娠40、70、90 天的母豬滴鼻感染, 結(jié)果引起母豬繁殖障礙, 仔豬出生后多為死胎、木乃伊胎、流產(chǎn), 或出生后在 1 周內(nèi)到 11 周內(nèi)死亡, 出生后存活的發(fā)病豬無臨床癥狀, 剖檢為胸腺萎縮、淋巴結(jié)腫大。由此證明了持續(xù)感染帶毒母豬所產(chǎn)仔豬對(duì)疫苗免疫后不能產(chǎn)生保護(hù)作用的免疫耐受機(jī)制。

另外, 我們模擬生產(chǎn)中的實(shí)際情況, 對(duì)無臨床癥狀的豬瘟陽(yáng)性經(jīng)產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬進(jìn)行免疫效力試驗(yàn)研究。兩頭母豬分別產(chǎn)下兩窩仔豬, 帶毒率分別為5/ 11和 12/ 14, 產(chǎn)仔時(shí)按仔豬產(chǎn)出順序隔頭進(jìn)行臨時(shí)豬瘟兔化弱毒疫苗接種, 1 h 后再吸初乳, 再用標(biāo)準(zhǔn)石門強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊。免疫豬瘟疫苗不能使帶毒仔豬產(chǎn)生免疫保護(hù)力, 接種疫苗的 5 頭豬在強(qiáng)毒攻擊后死亡4 頭。結(jié)果: 豬瘟病毒持續(xù)感染對(duì)胎兒發(fā)育有不同程度的影響; 豬瘟病毒持續(xù)感染母豬可經(jīng)過胎盤垂直傳播病毒給仔豬, 攻擊前死亡的豬全是帶毒豬; 吃初乳和疫苗接種不能阻止帶毒仔豬的死亡, 并且形成免疫偏離現(xiàn)象或免疫耐受現(xiàn)象, 導(dǎo)致免疫失敗, 甚至誘發(fā)豬瘟, 通過此項(xiàng)試驗(yàn)也得到了證實(shí)。通過病理切片觀察, 豬瘟病毒持續(xù)感染可導(dǎo)致母豬生殖器官產(chǎn)生病理變化, 特別是卵巢的病理變化, 使卵泡結(jié)節(jié)化, 降低或失去排卵功能, 最后導(dǎo)致功能障礙及繁殖障礙。

1. 3　帶毒公豬的垂直傳播　用 RT -PCR 檢測(cè)帶毒公豬自然交配所產(chǎn)死胎的病毒基因型, 結(jié)果表明: 死胎感染的病毒基因型與帶毒母豬原有的病毒基因型不同, 而與帶毒公豬的病毒基因型相同。試驗(yàn)證明帶毒種豬不僅能通過母豬胎盤垂直傳播, 而且能通過公豬精液垂直傳播豬瘟, 這是造成豬瘟持續(xù)感染的又一重要原因。

綜上所述, 豬瘟持續(xù)感染母豬造成的垂直傳播是引起仔豬死胎、木乃伊胎、弱胎及不發(fā)病的仔豬帶毒的主要原因之一, 加之它所產(chǎn)生的水平傳播方式, 還會(huì)造成其他豬的感染并污染環(huán)境。因此一旦種豬場(chǎng)有豬瘟病毒持續(xù)感染的種豬存在, 就會(huì)引起免疫耐受,導(dǎo)致免疫失敗, 時(shí)刻都有豬瘟發(fā)生的危險(xiǎn)。因此要根除豬瘟就必須從源頭抓起, 及時(shí)淘汰帶毒種豬, 對(duì)種豬場(chǎng)進(jìn)行徹底凈化。

1. 4　從細(xì)胞水平和分子生物學(xué)水平證實(shí)豬瘟持續(xù)感染對(duì)機(jī)體的影響

1. 4. 1　豬瘟病毒 E0 基因?qū)Τ掷m(xù)感染的影響　經(jīng)研究證實(shí), 豬瘟病毒的囊膜糖蛋白E0基因位于病毒粒子的表面, 對(duì)病毒的免疫、識(shí)別、吸附并進(jìn)入宿主細(xì)胞是十分重要的。在豬瘟病毒感染的細(xì)胞中,E0蛋白是惟一可以分泌到豬瘟病毒浸染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的糖蛋白。并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體, 用 E0 免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)致死劑量的保護(hù)性免疫反應(yīng), 同時(shí)也是病毒粒子吸附進(jìn)入易感細(xì)胞的必須蛋白。在病毒粒子中, E0以分子量為 100 kD 的同源二聚體的形式存在, 但糖蛋白E0并不像E2那樣具有跨膜區(qū), 而是以一種未知機(jī)制連接在病毒粒子的表面上, 對(duì)豬瘟病毒在細(xì)胞中的復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控過程中起重要作用。糖蛋白 E0 既是一種包膜糖蛋白, 又是一種核酸酶, 已有研究發(fā)現(xiàn), 豬瘟 E0 基因含有與地衣類及植物核酸酶同樣保守的兩個(gè)氨基酸基序 SLHGIWPG( 或 E) ( 28～36位) 和 EWNKHGWC( 75～82 位) , 基序中位于 30 和79 位的 H( 組氨酸) 為 RNase 的催化活性關(guān)鍵氨基酸殘基, 高度保守,E0蛋白的這種RNase活性已分別被試驗(yàn)所證實(shí)。值得注意的是,E0蛋白的RNase活性似乎與宿主細(xì)胞凋亡有關(guān), 重組 E0 蛋白能夠在體外誘導(dǎo)多個(gè)物種的淋巴細(xì)胞凋亡。

近年來 Hulst 等通過對(duì) C 株基因組全長(zhǎng) cDNA中的 E0 基因中的關(guān)鍵氨基酸殘基 H 進(jìn)行突變, 獲得了無E 0 RNase活性的病毒突變體, 表明該兩區(qū)域中的 H 對(duì) RNase 活性是不可缺少的。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)由此突變株建立的無 RNase 活性的突變株能導(dǎo)致 SK-6細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CP E) ,而這種RNase活性失活的豬瘟病毒將變成一種致病性病毒粒子, 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。推測(cè) E0 蛋白的RNase 活性可能對(duì)病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接關(guān)系, 而且在病毒復(fù)制過程中有可能發(fā)揮了重要作用。同時(shí)提示E0 在毒株演化中對(duì)于病毒適應(yīng)宿主細(xì)胞也可能具有重要作用, 也可以E0為靶蛋白來設(shè)計(jì)新的抗病毒策略。由此推測(cè)基因在豬瘟病毒持續(xù)感染、細(xì)胞嗜性等方面發(fā)揮重要作用。

1. 4. 2　豬瘟病毒對(duì)細(xì)胞的持續(xù)感染　利用田間分離鑒定的造成懷孕母豬與仔豬持續(xù)感染的豬瘟病毒株( CSF V39、CSF V22) 分別接種 PK15 細(xì)胞, 體外連續(xù)帶毒傳代。建立了穩(wěn)定的豬瘟病毒持續(xù)感染細(xì)胞模型, 獲得 CSFV39-PK15 和 CSFV22-PK15 病毒持續(xù)感染細(xì)胞株。用免疫熒光技術(shù)、RT -PCR技術(shù)、透射電鏡跟蹤監(jiān)測(cè)了CSFV 39-PK15 CSFV22-PK15持續(xù)感染細(xì)胞株連續(xù)傳代過程中病毒在細(xì)胞內(nèi)的存在情況。結(jié)果表明CSFV39-PK15細(xì)胞連續(xù)傳至 127代, CSFV22-PK15 連續(xù)傳至 57 代仍有豬瘟病毒存在, 表現(xiàn)為病毒對(duì)細(xì)胞持續(xù)感染的基本特征。在傳代過程中, 成熟病毒可以釋放到細(xì)胞外, 其相對(duì)感染量比感染原液至少低 2 個(gè)數(shù)量級(jí)。實(shí)驗(yàn)還表明: 豬瘟病毒可持續(xù)感染 PK15 細(xì)胞并使受感染細(xì)胞正常代謝機(jī)制發(fā)生明顯改善, 即持續(xù)感染的豬瘟病毒隨PK15 細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖而增殖, 且從被感染細(xì)胞正常代謝所需的供能物質(zhì)中獲得病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的能量, 從而干擾了細(xì)胞固有的生理生化過程, 使細(xì)胞的正常代謝速率減慢, 形成了細(xì)胞代謝熱功率變小及相同時(shí)段內(nèi)被感染細(xì)胞代謝總熱量降低等病理生理現(xiàn)象。此項(xiàng)研究為在細(xì)胞水平上研究豬瘟病毒的持續(xù)感染機(jī)理奠定了基礎(chǔ), 同時(shí)也為研究國(guó)內(nèi)溫和型豬瘟的發(fā)病機(jī)理提供材料, 具有理論意義和使用價(jià)值。

疫苗接種產(chǎn)生的中和抗體在體外對(duì)不同野毒株的中和作用表現(xiàn)出了很大差異, 耐受性高的毒株在血清 4 倍稀釋時(shí)才能中和, 耐受性低的毒株用 320 倍稀釋的抗血清就能將其中和。如果在體內(nèi)也是這樣, 那么在機(jī)體處于亞免疫狀態(tài)的情況下, 耐受性強(qiáng)的毒株就有可能侵入機(jī)體潛伏下來造成持續(xù)感染。另外, 機(jī)體的免疫狀態(tài)低下也可能是造成持續(xù)感染發(fā)生的重要原因。

2　疫苗方面的因素

2. 1　豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力試驗(yàn)　針對(duì)目前國(guó)內(nèi)對(duì)于我國(guó) C 株弱毒疫苗的疑問也作了一些試驗(yàn)研究, 在實(shí)驗(yàn)室采用非免疫豬和無豬瘟病原及抗體存在的豬進(jìn)行免疫保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn), 通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)疫苗株對(duì)我國(guó)目前流行的不同毒力( 高、中、低) 、不同地域、不同分離時(shí)間以及不同基因亞群的多個(gè)野毒進(jìn)行單獨(dú)、混合、交叉、一次及多次攻毒, 均能獲得完全保護(hù)。說明我國(guó)現(xiàn)用的豬瘟弱毒疫苗對(duì)目前流行的豬瘟野毒仍然有效, 初步證明現(xiàn)用疫苗的免疫原性沒有發(fā)生改變。另外法國(guó)用我國(guó)C株和T hiv erv al對(duì)慢性豬瘟病毒引起的母豬繁殖障礙均有效, 日本的GPE 疫苗株也獲得了同樣的結(jié)果。

2. 2　豬瘟兔化弱毒疫苗的分子生物學(xué)研究　

我們對(duì)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)豬瘟疫苗的廠家中隨機(jī)抽取部分批次的豬
瘟細(xì)胞疫苗, 共( 18 個(gè)批次) 以進(jìn)行免疫基因的分子生物學(xué)研究, 對(duì)這些疫苗的E2基因主要抗原編碼序列分析表明: 所有批次疫苗的核苷酸及氨基酸均呈現(xiàn)較高的同源性, 均為 99. 1% ～100% ; 對(duì) 3 個(gè)廠家生產(chǎn)的豬瘟細(xì)胞疫苗的E0基因進(jìn)行研究, 沒有一個(gè)堿基發(fā)生變異, 其 E0 基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性均保持在較高水平, 表明國(guó)內(nèi)所使用的疫苗株E0基因處于穩(wěn)定狀態(tài), 并且其穩(wěn)定性較E2基因高; 這初步說明目前我國(guó)國(guó)內(nèi)生藥廠生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒疫苗基本上是穩(wěn)定的, 由此證明疫苗的種毒也沒有發(fā)生變異。然而豬瘟病毒在細(xì)胞培養(yǎng)過程中繁殖滴度較低, 因此個(gè)別廠家豬瘟牛睪丸細(xì)胞苗存在滴度不夠, 由此影響到疫苗的免疫劑量, 個(gè)別地區(qū)存在著由此引起的免疫失敗的現(xiàn)象。

2. 3　非豬瘟病毒感染對(duì)豬瘟疫苗免疫效果的影響

　造成豬瘟持續(xù)感染的原因目前還不十分清楚, 經(jīng)初步研究還證實(shí): 豬瘟病毒反復(fù)多次感染及 PPV、PRV 和 PRRSV 混合感染均可造成豬瘟病毒在體內(nèi)的滯留而造成持續(xù)感染。利用 20 頭 9 月齡左右豬瘟、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸障礙綜合征抗原、抗體陰性豬, 將其分成 6 組, 分別利用豬細(xì)小病毒( PPV) 、豬偽狂犬病病毒(PRV ) 和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒( PRRSV ) 單獨(dú)或混合感染, 7 天后, 連同對(duì)照豬 4 頭, 免疫接種豬瘟兔化弱毒疫苗( HCLV) , 13 天后連同 4頭陰性對(duì)照豬一起攻擊豬瘟石門系強(qiáng)毒。整個(gè)試驗(yàn)期間分別每天測(cè)溫, 觀察臨床癥狀, 每周采集扁桃體和血樣做各種病毒抗原及抗體檢測(cè)。結(jié)果在攻擊石門系強(qiáng)毒后 2 周, 單獨(dú)和混合感染了非豬瘟病毒后接種 HCLV 疫苗的 4 個(gè)免疫組12頭豬除 1 頭外, 11頭全為HCV抗原檢測(cè)陽(yáng)性, 且多呈強(qiáng)陽(yáng)性; 而單一HCLV疫苗免疫組在豬瘟強(qiáng)毒攻擊后檢測(cè)不到HCV; 所有 HCL V 疫苗免疫豬均存活, 而非免疫對(duì)照組 4 頭豬全部在攻毒 16 日內(nèi)死亡。試驗(yàn)表明非豬瘟病毒感染的確對(duì)豬瘟疫苗免疫效果有影響, 能造成豬瘟疫苗免疫的失敗。

3　母源抗體及疫苗免疫程序?qū)σ呙缑庖叩挠绊?

模擬自然感染的亞臨床狀態(tài)和低抗體水平狀態(tài)來進(jìn)行不同劑量疫苗免疫效力的研究, 通過混合感染實(shí)驗(yàn)來對(duì)豬瘟免疫失敗原因進(jìn)行研究, 即從病原到機(jī)體全方位進(jìn)行綜合研究, 對(duì)豬瘟的防制具有十分重要的科學(xué)意義, 同時(shí)對(duì)其他產(chǎn)生免疫失敗的疾病具有重要的指導(dǎo)意義。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)母源抗體滴度對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫保護(hù)效力有影響, 當(dāng)母源抗體滴度在 16倍時(shí),將疫苗的免疫劑量加大到 2 到 4 頭份, 能抑制母源抗體干擾, 達(dá)到較好的免疫效果; 另外研究還顯示低水平的母源抗體不能抵抗豬瘟野毒感染, 因此及時(shí)監(jiān)測(cè)母源抗體滴度, 正確地按規(guī)程進(jìn)行疫苗免疫注射能確切地抵抗野毒的感染。

另外還進(jìn)行了豬瘟疫苗對(duì)帶毒仔豬免疫的影響研究、人工兩次野毒攻擊對(duì)疫苗免疫效力的影響和豬瘟抗體水平與感染量關(guān)系的研究。結(jié)果帶毒仔豬免疫后兩次攻毒雖不產(chǎn)生臨床癥狀, 但可隱性帶毒造成垂直傳播; 低水平的母源抗體不能抵抗野毒的感染, 而主動(dòng)免疫后的抗體水平只要在 8 倍以上, 均能抵抗強(qiáng)毒的攻擊。再次提示, 適當(dāng)加大免疫劑量可以適應(yīng)田間的帶有母源抗體仔豬的免疫。

人工試驗(yàn)條件, 超前免疫( 0～35～70 日齡) 和 20～60 日齡免疫程序其免疫保護(hù)效果完全相同, 而且優(yōu)于0～70 日齡兩次和 0日齡一次免疫的免疫效果。

超前免疫后不同時(shí)間吃初乳對(duì)疫苗免疫效果的影響各不相同; 試驗(yàn)還證明不論吸初乳后 0. 5h或 1 h注苗, 疫苗免疫效果均不如超前免疫的效果好。因此在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)堅(jiān)持超前免疫。

除此之外, 疫苗運(yùn)輸?shù)睦滏溝到y(tǒng)不完善、診斷方法不特異等多方面原因也是引起豬瘟免疫失敗的原因。

綜上所述豬瘟的免疫失敗是由上述多方面原因造成, 豬瘟的預(yù)防控制是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程。因此對(duì)后備種豬群和種豬群進(jìn)行凈化是防止產(chǎn)生繁殖障礙和惡性循環(huán)的關(guān)鍵手段, 清除持續(xù)感染帶毒豬, 培育健康的無豬瘟帶毒豬的種豬和后備種豬群是豬瘟綜合防制技術(shù)的核心; 制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的技術(shù)保障; 改善生態(tài)環(huán)境, 控制其他非豬瘟傳染病是實(shí)施豬瘟綜合防制技術(shù)的基礎(chǔ)。

作者：王琴, 寧宜寶
( 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所　國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室, 北京海淀 100081)