枯草芽孢桿菌系統(tǒng)總結(jié)

kiroco

枯草芽孢桿菌芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取5'-核苷酸酶的菌種。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對(duì)此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15-20g瓊脂能耐氧化；耐擠壓；耐在快速繁殖過程中，產(chǎn)生大量多種維生素、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白酶（特別是堿性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，高溫，能長(zhǎng)期耐60°C高溫，在120°C溫度下能存活20分鐘芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性染料，如孔雀綠（malachitegreen）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。

（1）將培養(yǎng)24小時(shí)左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。

（2）滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。

（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算約4—5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6％）染10分鐘。

（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。

（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色?！吭趐H為5.5~8.5時(shí)生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度為37°

一、目的要求

1、學(xué)習(xí)分離、純化噬菌體的基本原理和方法。

2、學(xué)習(xí)噬菌體效價(jià)測(cè)定的基本方法。

二、基本原理因?yàn)槭删w是專性寄生物，所以自然界中凡有細(xì)菌分布的地方，均可發(fā)現(xiàn)奇特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細(xì)菌的分布而分布的，例如糞便與陰溝污水中含有大量大腸桿菌，故也能很容易的分離到大腸桿菌噬菌體；乳牛場(chǎng)有較多的乳酸桿菌，也容易分離到乳酸桿菌噬菌體等。由于噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，噬菌體即從中釋放出來，所以，（a）在液體培養(yǎng)基內(nèi)可使混濁菌懸液變?yōu)槌吻?，此現(xiàn)象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；（b）在宿主細(xì)菌生長(zhǎng)的固體瓊脂平板上，噬菌體可裂解細(xì)菌而形成透明的空斑，稱噬菌體斑（圖1），一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè)噬菌斑，利用這一現(xiàn)象可將分離到的噬菌體進(jìn)行純化與測(cè)定噬菌體的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)是從陰溝污水中分離大腸桿菌噬菌體，剛分離出的噬菌體常不純，如表現(xiàn)噬菌斑的形態(tài)、大小不一致等，然后再進(jìn)一步純化。噬菌體的效價(jià)就是1毫升培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數(shù)量。效價(jià)測(cè)定的方法，一般應(yīng)用雙層瓊脂平板法。由于含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上，一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè)噬菌體斑，因此，能進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)。

三、器材37℃培養(yǎng)18小時(shí)的大腸桿菌斜面，陰溝污水；本實(shí)驗(yàn)均用普通肉膏蛋白胨培養(yǎng)基500毫升三角瓶?jī)?nèi)裝三倍濃縮的液體培養(yǎng)基100毫升，試管液體培養(yǎng)基，瓊脂平板，上層瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂0.7%，試管分裝，沒管4毫升），底層瓊脂平板（含培養(yǎng)基10毫升，瓊脂2%）大腸桿菌18小時(shí)培養(yǎng)液，大腸桿菌噬菌體10-2稀釋液（用肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基稀釋）0.9毫升液體培養(yǎng)基的小試管含4支，肉膏蛋白胨瓊脂平板（10毫升培養(yǎng)基，2％瓊脂，作底層平板用），含4毫升瓊脂培養(yǎng)基的試管（0.7％瓊脂，作上層培養(yǎng)基用）5管，滅菌小試管5支，滅菌1毫升吸管10支，48℃水浴箱等。滅菌吸管，滅菌玻璃途布器，滅菌蔡氏細(xì)菌濾器，滅菌抽濾器，恒溫水浴箱，真空泵等。

1、噬菌體的分離（1）制備菌懸液取大腸桿菌斜面一支，加4ml無菌水洗下菌苔，制成菌懸液。（2）增殖培養(yǎng)于100ml三倍濃縮的肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，加入污水樣品200ml與大腸桿菌懸液2ml，37℃培養(yǎng)12～24小時(shí)。（3）制備裂解液將以上混合培養(yǎng)液2500r/min離心15分鐘。將以滅菌的蔡氏過濾器用無菌操作安裝于滅菌抽濾瓶上，用橡皮管連接抽濾瓶與安全瓶，安全瓶再連接于真空泵（如圖2）。圖上的真空表接或不接均可。將離心上清夜倒入濾器，開動(dòng)真空泵，過濾除菌。所得濾液倒入滅菌三角瓶?jī)?nèi)，37℃培養(yǎng)過夜，以作無菌檢查。（4）確證試驗(yàn)經(jīng)無菌檢查沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的濾液作進(jìn)一步證明噬菌體的存在。（a）于肉膏蛋白胨瓊脂平板上加一滴大腸桿菌懸液，再用滅菌玻璃涂布器將菌液涂布成均勻的一薄層。(b)待平板菌液干后，分散滴加數(shù)小滴濾液于平板菌層上面，里37℃培養(yǎng)過夜。如果在滴加濾液處形成無菌生長(zhǎng)的透明噬菌斑，便證明濾液中有大腸桿菌噬菌體。

2、噬菌體的純化（1）如果已證明確有噬菌體的存在，便用接種環(huán)取菌液一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)，再加人0.1毫升大腸桿菌懸液，使混合均勻。(2）取上層瓊脂培養(yǎng)基，溶化并冷至48℃（可預(yù)先溶化、冷卻，放48℃水溶箱內(nèi)備用）,加入以上噬菌體與細(xì)菌的混合液0.2毫升，立即混勻。(3）并立即倒人底層培養(yǎng)基上，混勻。置37℃培養(yǎng)12小時(shí)。(4）此時(shí)長(zhǎng)出的分離的單個(gè)噬菌斑，其形態(tài)、大小常不一致，再用接種針在單個(gè)噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌體，接入含有大腸桿菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)。于37℃培養(yǎng)。（5）等待管內(nèi)菌液完全溶解后，過濾除菌，即得到純化的噬菌體。（以上（1)(2)(3）三步驟，目的是在平板上得到單個(gè)噬菌斑，能否達(dá)到目的，決定于所分離得到的噬菌體濾液的濃度和所加濾液的量，最好在做無菌實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，由教師先做頂備試臉，若平板上的噬菌體連成一片，則需減少接種量（少于一環(huán)）或增加液體培養(yǎng)基的量；若噬菌斑太少，則增加接種量。以免全班同學(xué)重做）。

3、高效價(jià)噬菌體的制備剛分離純化所得到的噬菌體往往效價(jià)不高，需要進(jìn)行增殖。將純化了的噬菌體濾液與液體培養(yǎng)基按l:10的比例混合，再加入大腸桿菌懸液適量（可與噬菌體濾液等量或1/2的量），培養(yǎng)，使增殖，如此重復(fù)移種數(shù)次，最后過濾，可得到高效價(jià)的噬菌體制品。

4、噬菌體是效價(jià)測(cè)定（1）稀釋噬菌體（a）將4管含有0.9毫升液體培養(yǎng)基的試管分別標(biāo)寫10-3，10-4，10-5和10-6。(b)用1毫升無菌吸管吸0.1毫升10-2大腸桿菌噬菌體，注入10-3的試管中，旋搖試管，使混勻。(c)用另一支無菌吸管從吸0.1毫升10-3大腸桿菌噬菌體，注入10-4的試管中，旋搖試管，使混勻。余類推，稀釋到10-6管中，混勻，如圖所示。（2)噬菌體與菌液的混合（a）將5支滅菌空試管分別標(biāo)寫10-4，10-5，10-6，10-7和對(duì)照(b）用吸管從10-3噬菌體稀釋管吸0.1毫升加人10-4的空試管內(nèi)，用另一支吸管從10-4稀釋管內(nèi)吸0.1毫升時(shí)加人10-5空試管內(nèi)，如圖1直至10-7管。(C）將大腸桿菌培養(yǎng)液搖勻，用吸管取菌液0.9毫升加人對(duì)照試管內(nèi)，再吸0.9毫升假如10-7試管，如此從最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9毫升大腸桿菌培養(yǎng)液。（D）將以上試管旋搖混勻。（1）將5管上層培養(yǎng)基融化，標(biāo)寫10-4，10-5，10-6，10-7和對(duì)照，使冷卻至48℃，并放入48℃水浴箱內(nèi)。（2）分別將4管混合液和對(duì)照管對(duì)號(hào)加入上層培養(yǎng)基試管內(nèi)。每一管加入混合液后，立即旋搖混勻。（3）混合液加入上層培養(yǎng)基中（4）接種了的上層培養(yǎng)基倒入底層平板上(a）將旋搖均勻的上層培養(yǎng)基迅速對(duì)號(hào)倒入底層平板上，放在臺(tái)面上搖勻，使上層培養(yǎng)基鋪滿平板。(b）凝固后，放置37℃培養(yǎng)(5)觀察平板中的噬菌斑將每個(gè)稀釋度的噬菌斑數(shù)目記錄于實(shí)驗(yàn)報(bào)告表格內(nèi)，并選取30-300個(gè)噬菌斑的平板計(jì)算算每毫升未稀釋的原液的噬菌體數(shù)（效價(jià)）。噬菌體效價(jià)=噬菌斑數(shù)x稀釋倍數(shù)x10常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂

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