出口食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗方法

kiroco

中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

SN 0176—92出口食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗方法
代替 ZB X09 006—86
Method for detection of bacilluscereus in food for export
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1　主題內(nèi)容與適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的檢驗。
2　設(shè)備和材料
2.1　吸管：容量1.0mL和10.0mL,具0.1mL刻度。
2.2　菌落計數(shù)器。
2.3　均質(zhì)器。
2.4　厭氧培養(yǎng)裝置。
2.5　渦動攪拌器。
2.6 L形玻璃棒。
2.7　恒溫培養(yǎng)箱: 30℃及36±1℃。
3　培養(yǎng)基和試劑
3.1　甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)。
3.2　胰酪胨大豆多粘菌素肉湯。
3.3　酚紅葡萄糖肉湯。
3.4　硝酸鹽肉湯。
3.5　營養(yǎng)瓊脂。
3.6 L-酪氨酸營養(yǎng)瓊脂。
3.7　溶菌酶營養(yǎng)肉湯。
3.8　改良V-P培養(yǎng)基。
3.9　動力培養(yǎng)基。
3.10 胰酪胨大豆羊血瓊脂(TSSB)。
3.11 Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液。
3.12 亞硝酸鹽試劑。
3.13 V-P試劑。
3.14 堿性復(fù)紅染色液。
4　樣品的保存和送檢
待檢樣品應(yīng)保持在6℃以下運送并盡可能不使其冷凍。送達實驗室后,應(yīng)保存于4℃并
盡快進行檢驗。如在4d內(nèi)不能進行檢驗,應(yīng)將樣品儲存在-20℃,檢驗前再于室溫下解凍。
脫水食品可在常溫下送檢和儲存。
5　樣品的制備
5.1　以無菌操作用滅菌刀、剪將樣品剪碎。稱取50 g放于無菌均質(zhì)杯中。
5.2　加450 mL無菌磷酸鹽緩沖稀釋液于均質(zhì)杯中以18000～20000 r/min均質(zhì)2min。制成
1 : 10樣品稀釋液。
5.3　取1: 10稀釋液10.0 mL加到含有90.0 mL無菌磷酸鹽緩沖液的稀釋瓶中,充分混勻制
成1 : 100的稀釋液。
5.4　每個稀釋度換用1支10.0mL滅菌吸管,按上述操作程序進行10倍遞增稀釋直至10**-6。
6　檢驗步驟
6.1　平板計數(shù)法
6.1.1　取各稀釋液0.1mL接種到MYP瓊脂平板上。用滅菌L形玻璃棒均勻涂布于整個瓊脂
表面。每稀釋度接種兩個MYP瓊脂平板。
6.1.2　將平板置于30℃培養(yǎng)24 h。
6.1.3　選取具有15～150個典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板,進行計數(shù)。并計算同
一稀釋度兩個平板的平均菌落數(shù)。
蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生成的菌落為微粉紅色,環(huán)繞產(chǎn)生卵磷脂酶沉淀環(huán)。
如反應(yīng)不典型,可繼續(xù)培養(yǎng)24h再計數(shù)。
6.1.4　計數(shù)后,從每個平板至少選取5個已計數(shù)的菌落分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面,于30℃
培養(yǎng)24 h,按第6章進行證實試驗。
6.1.5　根據(jù)證實試驗確定為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù),按比例計算出該皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿
菌菌落數(shù),然后乘其稀釋倍數(shù)再乘以10,即得每克樣品所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)并作出報告。
例:將檢樣10**-4稀釋液0.1mL涂布于MYP瓊脂平板上,生成的可疑菌落數(shù)為25個,取5個進
行鑒定,證實為蠟樣芽孢桿菌的是4個,則1 g樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)為(25×4/5)×10**4
×10＝2×10**6。
6.2　最近似值(MPN)法
適用于污染蠟樣芽孢桿菌數(shù)不大于10**3個/g的食品。
6.2.1　選用三管法MPN系列。取10**-1、10**-2、10**-3三種稀釋液,每種稀釋液接種3
管胰酪胨大豆多粘菌素肉湯,每管接種1mL。
6.2.2　置于30℃培養(yǎng)48±2 h。
6.2.3　從長菌的試管取培養(yǎng)物劃線接種到MYP瓊脂平板上。
6.2.4　置30℃培養(yǎng)24～48 h。
6.2.5　從MYP瓊脂平板上挑取粉紅色繞有沉淀環(huán)的單個菌落,接種營養(yǎng)瓊脂斜面,置30℃
培養(yǎng)24 h,供作證實試驗。
6.2.6　根據(jù)證實試驗確定為蠟樣芽孢桿菌的管數(shù),由MPN表 [附錄C(補充件)]計算蠟樣芽
孢桿菌的MPN值/g,并作出報告。
7　證實試驗
7.1　形態(tài)觀察
取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性大桿菌,呈
短鏈或長鏈,芽孢呈橢圓形位于菌體中央或偏端,不使菌體脹大。
7.2　生化學(xué)性狀
7.2.1　葡萄糖發(fā)酵試驗
接種于酚紅葡萄糖肉湯中,厭氧條件下35℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基應(yīng)由紅色變?yōu)辄S色(表明
本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)酸)。
7.2.2　硝酸鹽還原試驗
接種于硝酸鹽肉湯中,35℃培養(yǎng)24h。加硝酸鹽試劑后應(yīng)為陽性反應(yīng)(紅色)。
7.2.3 V-P試驗
接種于改良V-P培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)48 h。加V-P試劑及肌酸數(shù)粒,靜止1h,應(yīng)為陽性
反應(yīng)(伊紅色)。
7.2.4　L-酪氨酸分解試驗
接種于L-酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)48 h,陽性反應(yīng)菌落周圍培養(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)澄清
透明區(qū)(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性時應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)72 h再觀察。
7.2.5　溶菌酶試驗
用直徑2mm接種環(huán)取純菌懸液一環(huán),接種于溶菌酶肉湯中,35℃培養(yǎng)24h。該菌在本培
養(yǎng)基(含0.001％的溶菌酶)中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng),應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
7.2.6　卵磷脂酶試驗
接種于MYP瓊脂平板上,35℃培養(yǎng)24 h。陽性反應(yīng)菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)沉淀環(huán)(表示產(chǎn)生卵
磷脂酶)。
7.3　蠟樣芽孢桿菌與類似菌的鑒別試驗
7.3.1　動力試驗
用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)24h。有動力蠟樣芽孢桿菌
應(yīng)沿穿刺線呈擴散生長,而蕈狀芽孢桿菌常常呈絨毛狀生長,形成所謂的蜂巢狀擴散。也
可用懸滴法檢查。蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌通常運動極為活潑,而炭疽桿菌則不運
動。
7.3.2　根狀生長試驗
用接種環(huán)取培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,30℃培養(yǎng)18～24h。蠟樣芽孢桿菌群的多
數(shù)菌株形成粗糙的似毛玻璃狀或融蠟狀的菌落。其中唯獨蕈狀芽孢桿菌則形成根狀生長
的特征。
7.3.3　溶血試驗
取培養(yǎng)物接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板上,30～32℃培養(yǎng)24h。蠟樣芽孢桿菌落周
圍呈現(xiàn)β型完全溶血的溶血環(huán)。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象,而
炭疽芽孢桿菌通常為不溶血。
7.3.4　蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素試驗
取經(jīng)30℃培養(yǎng)24h并于室溫放置2～3d的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物少許于載玻片上,滴加蒸餾
水混涂成薄膜。經(jīng)自然干燥,微火固定后,于涂膜加甲醇半分鐘后傾掉,再通過火焰干燥,
于載片上滴滿0.5％堿性復(fù)紅液,放火焰上加熱微見蒸氣(勿使染液沸騰)后持續(xù)1.5min,
移去火焰,使載片放置0.5min再傾去染液。用潔凈自來水徹底清洗、晾干、鏡檢。觀察
有無游離芽孢和染成黑色的菱形毒素結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽孢形成的不豐富,應(yīng)將培養(yǎng)
物置室溫2～3d再行檢查。蘇云金芽孢桿菌用此法檢測為陽性,而蠟樣芽孢桿菌群的其
他菌種則為陰性。
7.3.5　結(jié)果解釋及報告
符合蠟樣芽孢桿菌群的特征,有活潑的動力,很強的溶血能力,不形成根狀生長和不
產(chǎn)生蛋白結(jié)晶毒素,可報告為蠟樣芽孢桿菌。
對偶爾遇到的一些少數(shù)可疑菌株,可以根據(jù)需要進行其他試驗,如青霉素酶、噬菌
體試驗等。

附　錄 A
培 養(yǎng) 基 制 備
(補充件)

A1 甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基(MYP)
a. 　基礎(chǔ)瓊脂
牛肉膏　　　　　　　　　　　1.0g
蛋白胨 10.0g
D-甘露醇 10.0g
氯化鈉 10.0g
瓊　脂 15.0g
酚　紅 0.025g(配成溶液加入)
蒸餾水　　　　　　　　　　 稀釋至900mL
b. 50％卵黃液 50mL
c. 多粘菌素B 100 IU/mL
將a.中的前5種成分加入蒸餾水中加熱溶解,校正pH至7.2±0.1,加入酚紅溶液,混勻
后分裝燒瓶中,每瓶225 mL。121℃高壓滅菌15min。用時加熱溶化,冷至50℃后每瓶加入
50％卵黃液12.5mL和2.5mL多粘菌素B溶液,混勻后傾注滅菌平皿,每皿15～18mL。用前應(yīng)
將平板置室溫約24 h。
注：①50％卵黃液：取鮮雞蛋,用硬刷將蛋殼徹底洗凈,瀝干,放于70％酒精溶液中
浸泡1 h。以無菌操作取出卵黃,加入等量滅菌生理鹽水,混勻后備用。
②多粘菌素B溶液：在50mL滅菌蒸餾水中溶解500 000國際單位的無菌硫酸鹽多
粘菌素B。
A2　胰酪胨大豆多粘菌素肉湯
胰酪胨 17.0g
植物胨　　　　　　　　　　 3.0g
氯化鈉　　　　　　　　　　 5.0g
磷酸氫二鉀　　　　　　　　 2.5g
葡萄糖　　　　　　　　　　 2.5g
蒸餾水　　　　　　　　　　　 稀釋至1000mL
pH7.3±0.1
將上述各成分溶解在蒸餾水中,煮沸2min,分裝大試管,每管15 mL,121℃高壓滅菌
15min。臨用時每管加入0.5％多粘菌素B溶液0.1mL混勻即可。
注：多粘菌素B溶液：在33.3mL滅菌蒸餾水中溶解500 000國際單位無菌硫酸鹽多粘
菌素B。
A3　酚紅葡萄糖肉湯
(月示)胨　　　　　　　　　　10.0g
牛肉膏　　　　　　　　　　 1.0g
氯化鈉　　　　　　　　　　 5.0g
葡萄糖　　　　　　　　　　 5.0g
酚　紅　　　　　　　　　　0.018g(配成溶液加入)
蒸餾水　　　　　　　　　　　稀釋至1000mL
pH7.4±0.1
將除酚紅外的各成分溶解于蒸餾水并稀釋至1000mL。校正pH后加入酚紅溶液,混勻,
分裝試管,每管3 mL。121℃高壓滅菌10min備用。最終pH7.4±0.1
A4　硝酸鹽肉湯
牛肉膏　　　　　　　　　　 3.0g
蛋白胨　　　　　　　　　　　5.0g
硝酸鉀　　　　　　　　　　　1.0g
蒸餾水　　　　　　　　　　　稀釋至1000mL
pH7.0±0.1
將上述各成分溶解于蒸餾水并稀釋至1000mL。校正pH后分裝試管,每管5mL,121℃高
壓滅菌15min。
A5　營養(yǎng)瓊脂
牛肉膏　　　　　　　　　　　3.0g
蛋白胨　　　　　　　　　　　5.0g
瓊 脂 稀釋至1000mL
pH7.2±0.1
將各成分于蒸餾水中加熱溶解。校正pH后分裝試管,每管5～7mL；或分裝燒瓶,每瓶
100～150mL。121℃高壓滅菌15 min。將試管取出,制成斜面；如制平板,可將滅菌的瓊
脂冷至45～50℃傾注滅菌平皿,每皿18～20mL。
A6 L-酪氨酸營養(yǎng)瓊脂
營養(yǎng)瓊脂 100mL
5％滅菌L-酪氨酸懸液 10mL
將100mL營養(yǎng)瓊脂溶化,冷至45℃,加入5％的滅菌L-酪氨酸懸液10mL,充分混勻后,
分裝試管,每管3.5mL。制成的斜面應(yīng)迅速冷卻防止L-酪氨酸分離而出。
注：L-酪氨酸懸液：將0.5g酪氨酸加10mL蒸餾水混勻,121℃高壓滅菌15min。
A7　溶菌酶營養(yǎng)肉湯
牛肉膏　　　　　　　　　　　3.0g
蛋白胨　　　　　　　　　　　5.0g
蒸餾水　　　　　　　　　　　稀釋至1000mL
0.1%溶菌酶溶液 10.0mL
pH6.8±0.1
將上述成分(溶菌酶溶液除外)溶解于蒸餾水并稀釋至1000mL。校正pH后,分裝于燒
瓶中,每瓶99mL。121℃高壓滅菌15min。于每瓶中加入0.1％溶菌酶溶液1mL,混勻后分裝
滅菌試管,每管2.5mL。
注：溶菌酶溶液：在65mL滅菌的0.1mol/L鹽酸中加0.1g溶菌酶。煮沸20min溶解后,
再用滅菌的0.1mol/L 鹽酸稀釋至100mL。
A8　改良 V-P培養(yǎng)基
(月示)蛋白胨　　　　　　　　 7.0g
葡萄糖　　　　　　　　　　　 5.0g
氯化鈉　　　　　　　　　　　 5.0g
pH6.5±0.1
將上述各成分溶解于蒸餾水并稀釋至1000 mL。校正pH后分裝試管,每管5mL。121℃
高壓滅菌10 min備用。
A9　動力培養(yǎng)基
胰酪胨 10.0g
酵母膏　　　　　　　　　　　 2.5g
葡萄糖　　　　　　　　　　　 5.0g
磷酸氫二鈉　　　　　　　　　 2.5g
瓊　脂 3.0g
蒸餾水　　　　　　　　　　　 稀釋至1000mL
pH7.4±0.2
將上述各成分于蒸餾水加熱溶解并稀釋至1000 mL。校正pH后,分裝試管,每管2mL。
121℃高壓滅菌10 min備用。
A10 胰酪胨大豆羊血瓊脂(TSSB)
胰酪胨 15.0g
植物胨　　　　　　　　　　　 5.0g
氯化鈉　　　　　　　　　　　 5.0g
瓊　脂 15.0g
蒸餾水　　　　　　　　　　　稀釋至1000mL
pH7.0±0.2
將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解。芽孢桿菌校正pH后,分裝燒瓶,每瓶100mL。121℃高壓滅
菌15min。水浴中冷至45～50℃加入5mL無菌脫纖維羊血,混勻后傾注平板,每皿18～20mL。

附　錄 B
試　劑　配　制
(補充件)

B1　Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液
在500mL蒸餾水中溶解磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g,用1mol/L氫氧化鈉溶液約175mL校
正pH至7.2,再用蒸餾水稀釋至1000 mL,制成儲存液于冰箱中儲存。取原液1.25mL,用蒸
餾水稀釋至1000 mL。分裝試管,每管90 mL,121℃高壓滅菌15 min。
B2　亞硝酸鹽試劑
a.　 試劑A：對氨基苯磺酸8.0g,溶解于5mol/L,乙酸1000 mL中。
b.　 試劑B：α-萘酚2.5g溶解于5mol/L乙酸1000 mL中。
B3　V-P試劑
a.　 5％α-萘酚溶液：取α-萘酚5.0g溶解于100 mL無水乙醇中。
b. 40％氫氧化鉀溶液：將氫氧化鉀40 g于蒸餾水中溶解并稀釋至100 mL。
c. 肌氨酸結(jié)晶。
B4　堿性復(fù)紅染色液
取堿性復(fù)紅0.5g溶解于20mL乙醇中,再用蒸餾水稀釋至100mL,濾紙過濾后儲存?zhèn)溆谩?br />
附　錄 C
1g樣品中最近似值(MPN)檢索表
(補充件)

三管法采用0.1,0.01,0.001g。
━━━━━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━
陽 性 管 數(shù) ┃ ┃ 陽 性 管 數(shù) ┃
━━━━━━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0. 001 ┃ ┃ 0.1 0.01 0.001 ┃
━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━
0 0 0 ┃ ＜3 ┃ 2 0 0 ┃ 9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃ 14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃ 20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃ 26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃ 15
0 1 1 ┃ 6.1 ┃ 2 1 1 ┃ 20
0 1 2 ┃ 9.2 ┃ 2 1 2 ┃ 27
0 1 3 ┃ 12 ┃ 2 1 3 ┃ 34
0 2 0 ┃ 6.2 ┃ 2 2 0 ┃ 21
0 2 1 ┃ 9.3 ┃ 2 2 1 ┃ 28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃ 35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃ 42
0 3 0 ┃ 9.4 ┃ 2 3 0 ┃ 29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃ 36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃ 44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃ 53
━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━
1 0 0 ┃ 3.6 ┃ 3 0 0 ┃ 23
1 0 1 ┃ 7.2 ┃ 3 0 1 ┃ 39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃ 64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃ 95
1 1 0 ┃ 7.3 ┃ 3 1 0 ┃ 43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃ 75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃ 120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃ 160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃ 93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃ 150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃ 210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃ 290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃ 240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃ 460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃ 1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100
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芽孢桿菌附加說明：
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家進出口商品檢驗局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國黑龍江進出口商品檢驗局、遼寧進出口商品檢驗局負責(zé)起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人李廷泰、唐守亭。
本標(biāo)準(zhǔn)參考美國公職分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)法定分析方法第14版,第46章,第46.106～
46.114節(jié)(1984年)。
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中華人民共和國國家進出口商品檢驗局1992-12-28批準(zhǔn) 1993-05-01實施