乳桿菌酵母菌及混菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

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　　導(dǎo)讀

　　近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵技術(shù)來(lái)開發(fā)新型飼料資源越來(lái)越受到人們的重視。通過(guò)微生物發(fā)酵，可使飼料或者飼用原料中含有更多的活性益生菌菌體、各種消化酶及代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物及活性小肽、抑菌物質(zhì)，同時(shí)使飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低，起到促進(jìn)生長(zhǎng)、維持動(dòng)物健康的作用。

　　常用的微生物發(fā)酵菌種主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌。乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內(nèi)的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產(chǎn)性能，同時(shí)，能有效抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，控制仔豬的腹瀉，減少抗生素的使用，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值；酵母菌富含蛋白質(zhì)、氨基酸(粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)5O%)及多種維生素，同時(shí)含有多種動(dòng)物所需的消化酶(α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等)和其他代謝產(chǎn)物，在提高動(dòng)物的免疫、生長(zhǎng)和繁殖能力方面具有顯著功效，是天然綠色生物飼料添加劑，價(jià)格低廉并有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求旺盛，具有很好的應(yīng)用前景；酸溶蛋白即分子質(zhì)量較低的蛋白水解物，包括肽和游離氨基酸，使用酸溶蛋白含量指標(biāo)評(píng)價(jià)發(fā)酵酶解粕類蛋白質(zhì)品質(zhì)，既可以反映其中抗原蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，進(jìn)而揭示該類抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被消除的程度，又可一定程度上反映肽含量的高低，表明畜禽生長(zhǎng)必需氨基酸含量增加，發(fā)酵飼料中氨基酸組成在向優(yōu)質(zhì)化方向轉(zhuǎn)化。

　　目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵飼料在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用和理論研究較多。但國(guó)內(nèi)外對(duì)發(fā)酵飼料的研究主要集中在發(fā)酵菌株類型、生理功能、飼喂效果上，對(duì)影響發(fā)酵飼料品質(zhì)的發(fā)酵方式、生產(chǎn)工藝條件、發(fā)酵眾多代謝物質(zhì)的活性成分分析等研究相對(duì)較少，對(duì)發(fā)酵飼料眾多代謝產(chǎn)物的有效成分缺乏較深入的研究。本試驗(yàn)旨在研究適宜哺乳母豬全價(jià)飼料發(fā)酵的乳桿菌和酵母菌的篩選和復(fù)配發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵飼料pH、活菌數(shù)、總酸含量、粗蛋白和酸溶蛋白含量的影響，為乳桿菌和酵母菌發(fā)酵全價(jià)飼料提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　1.1.1 發(fā)酵基料和菌株

　　玉米豆粕型配合飼料。

　　6株乳桿菌菌株(BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114；4株酵母菌菌株(BLCC4-0048、BLCC4-0021、BLCC4-0044、BLCC4-0042)。

　　1.1.2 培養(yǎng)基

　　MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，硫酸鎂0.5gm，硫酸錳0.3g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5gm，吐溫-80 1 mL/L，pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

　　酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YEPD)培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH自然，121 ℃滅菌20min。

　　1.1.3 化學(xué)試劑

　　葡萄糖；蛋白胨；牛肉膏、酵母膏；硫酸鎂、硫酸錳；檸檬酸銨；乙酸鈉；吐溫-80、氫氧化鈉；磷酸二氫鉀；氯化鈉；LBS瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基。所用實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；THZ-C恒溫振蕩器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；KDN-103F自動(dòng)定氮儀、HYP-1008)八孔消化爐。

　　1.3 試驗(yàn)方法

　　1.3.1 酵母菌和乳桿菌發(fā)酵液的制備

　　將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用：將4℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的鹽水瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用。

　　1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　(1)乳桿菌的篩選

　　稱取一定量的基料按料水比1：0.4(g：mL)，以裝袋量為100 g/袋裝袋，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2％接種量接入培養(yǎng)好的乳桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)和總酸含量。

　　(2)酵母菌的篩選

　　稱取～定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1：0.4(g：mL)，裝量50 瓶，按2％接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定活菌數(shù)和粗蛋白含量。

　　(3)混菌發(fā)酵

　　將上述篩選得到的乳桿菌和酵母菌進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，料水比為1：0.4(g：mL)，以裝袋量為100g/袋 裝袋，接種量2％，乳桿菌：酵母菌(3：2)，生料發(fā)酵，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)、總酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量。

　　1.3.3 測(cè)定方法

　　pH測(cè)定：取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。

　　乳桿菌和酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳桿菌和酵母菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。

　　總酸含量的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法測(cè)定。

　　粗蛋白含量：參照國(guó)標(biāo)GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》測(cè)定。

　　酸溶蛋白含量：參照QB/T 2653-2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g，加入15％三氯乙酸溶液25 mL，混合均勻，靜置30 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4 000 r/min條件下離心10 min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的測(cè)定方法。結(jié)果為占粗蛋白的百分含量。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1 乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

　　乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響見(jiàn)表1。由表1可知，發(fā)酵24 h時(shí)除菌株BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中以菌株BLCC2-0015最低；48 h和72 h時(shí)， 各pH值均有所下降， 以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092較低，菌株BLCC2-0015在發(fā)酵48 h時(shí)pH值達(dá)到最低，僅為4.12。各菌株發(fā)酵活菌數(shù)均在109CFU/g水平， 各取樣時(shí)問(wèn)點(diǎn)時(shí)均以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092活菌數(shù)較高，其中菌株BLCC2-0092發(fā)酵48 h活菌數(shù)達(dá)到8.1×109CFU/g。各菌株發(fā)酵料總酸含量均逐漸升高， 以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組(P<0.05)。其中以菌株BLCC2-0015發(fā)酵72 h時(shí)最高，為24.84 mg/g。

　　綜合考慮，選擇適宜哺乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳桿菌為菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092。

　　2.2 酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

　　酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響見(jiàn)表2。由表2可知，菌株BLCC4-0048在發(fā)酵24 h、48 h和72 h時(shí)活菌數(shù)均在108CFU/g水平，其余菌株均在109CFU/g水平。24 h以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，其次是菌株BLCC4-0042；48 h和72 h時(shí)均以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，72 h時(shí)為53.5x108CFU/g；其次是菌株BLCC4-0042，兩者間差異不顯著(P>0.05)。由粗蛋白含量來(lái)看，各菌株間差異均不顯著(P>0.05)，其中以菌株BLCC4-0021和菌株BLCC4-0042發(fā)酵時(shí)稍高。

　　綜合考慮，選擇適宜作為發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)飼料的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042。

　　2.3 混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

　　利用篩選得到的乳桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042混菌發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)飼料，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵(乳桿菌/酵母菌為3：2，接種量2％)，發(fā)酵溫度為32℃。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，考察混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

　　由表3可知，R0015+J0021、R0015+J0042發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的pH值均顯著低于R0092+J0021、R0092+J0042厭氧聯(lián)合發(fā)酵(P<0.05)。各復(fù)配組在各時(shí)間點(diǎn)的乳桿菌活菌數(shù)均在109CFU/g水平，且R0015復(fù)配發(fā)酵時(shí)乳酸桿菌活菌數(shù)較高；24 h時(shí)R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵活菌數(shù)顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵時(shí)(P<0.05)。且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵72 h時(shí)酵母菌活菌數(shù)低于接種量。R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵組粗蛋白含量均高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵組，其中24 h和48 h時(shí)差異顯著(P<0.05)。酸溶蛋白含量和總酸含量結(jié)果一致，R0015+J0021和R0015+J0042復(fù)配發(fā)酵組均顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵組(P<0.05)；R0015+J0021最高。

　　綜合考慮，選擇乳桿菌BLCC2-0015與酵母菌BLCC4-0021(3：2)聯(lián)合發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)料效果最優(yōu)。發(fā)酵24 h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.0x 108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41％，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41％，總酸含量可達(dá)到20.68 mg/g。

　　3討 論

　　本試驗(yàn)對(duì)菌種庫(kù)保存的性能優(yōu)良的乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)料飼料，根據(jù)發(fā)酵后飼料pH值、活菌數(shù)、粗蛋白、酸溶蛋白和總酸等指標(biāo)，篩選出適宜發(fā)酵的乳桿菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，適宜發(fā)酵的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042?；炀l(fā)酵時(shí)，以BLCC2-0015+BLCC4-0021(3：2)復(fù)配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24 h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.0x108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41％，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41％，總酸含量可達(dá)20.68 mg /g。

　　注：本文由生物飼料開發(fā)國(guó)家工程研究中心（BFC）小編整理發(fā)布，如有任何建議或意見(jiàn)及投稿等，請(qǐng)您加小編微信（13260429991）交流互動(dòng)。
　　參考文獻(xiàn)略
　　責(zé)編：馬維軍；審閱：張博 博士
　　（來(lái)源：中國(guó)釀造；作者：亓秀曄，謝全喜，谷巍等）

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