實(shí)驗(yàn)室工作須知及簡(jiǎn)單操作方法

sdjgq · 發(fā)表于 2006-10-20 20:05:55

一、實(shí)驗(yàn)須知
在微生物的實(shí)驗(yàn)中，要求工作謹(jǐn)慎，嚴(yán)防實(shí)驗(yàn)室污染，防止事故，有科學(xué)態(tài)度。
1.嚴(yán)格防止病原微生物散布
第一，在實(shí)驗(yàn)室工作，應(yīng)穿戴工作衣帽，每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要將這些衣帽浸于消毒藥水中(如5％石炭酸)或高壓消毒后再進(jìn)行洗滌。
第二，沾有病原微生物的器皿及廢棄培養(yǎng)物，應(yīng)置于指定的地點(diǎn)，消毒后再進(jìn)行洗滌。檢查用過(guò)的動(dòng)物尸體、臟器、血液等病料，應(yīng)嚴(yán)加消毒，深埋或焚燒。
第三，接種環(huán)、接種針等器械，用前用后必須置火焰中燒灼。
第四，含有培養(yǎng)物的試管，應(yīng)豎列在試管架上，不可平放在桌子上，以防其中液體流出，污染桌面和地面。

第五，實(shí)驗(yàn)室中禁止飲食、吸煙及用嘴濕潤(rùn)鉛筆和標(biāo)簽等物，也不要以手指等與面部接觸。
第六，進(jìn)行危險(xiǎn)病科檢驗(yàn)時(shí)不要互相交談或思考其他問(wèn)題，以免分散注意力而發(fā)生意外。
第七，實(shí)驗(yàn)室中若發(fā)生意外，如工作人員吸入細(xì)菌，劃破皮膚，細(xì)菌或病料污染桌面或地面時(shí)，人員應(yīng)立即自行處理，必要時(shí)到醫(yī)院就醫(yī)，被病原微生物污染的地點(diǎn)，應(yīng)敷以濃消毒藥(5％石炭酸等)覆蓋過(guò) 夜。
第八，菌種或毒種不得隨意帶出實(shí)驗(yàn)室，若必需帶出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)章制度辦理。
第九，工作完畢后應(yīng)先用消毒藥水泡手，后用清水沖洗。
2.預(yù)防火災(zāi)發(fā)生
一切易燃品應(yīng)遠(yuǎn)離火源。不可將酒精燈傾向另一酒精燈引火，以免發(fā)生爆炸。電爐用完后應(yīng)立即斷電。電器發(fā)生故障應(yīng)立即修理。
3.標(biāo)記和記錄
標(biāo)記和記錄所有各種試劑、染料、培養(yǎng)物等，均需標(biāo)記明確。每日操作及觀察結(jié)果，均應(yīng)詳細(xì)記錄。
4.保持清潔衛(wèi)生與秩序井然
每日工作前，應(yīng)清潔地面、桌面。實(shí)驗(yàn)室中的物資、器具，存放要有一定位置，工作結(jié)束后放回原處或指定地點(diǎn)。每日下班前，搞好實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生和器具整理。
二、玻璃器皿的準(zhǔn)備
微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的玻璃器皿種類(lèi)很多，在選購(gòu)時(shí)注意各種規(guī)格和質(zhì)量，一般應(yīng)能耐受多次高溫滅菌，且以中性者為宜。玻璃器皿用前必須干燥清潔，而且要絕對(duì)無(wú)菌。

1.新購(gòu)入玻璃器皿的處理
新購(gòu)的玻璃器皿，常附有游離堿質(zhì)，不可直接使用，應(yīng)先在1％～2％鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時(shí)，以中和其堿質(zhì)，然后再用肥皂水及清水刷洗，以除去遺留的酸質(zhì)。
2.用過(guò)的玻璃器皿的消毒和處理
凡被病原微生物沾污過(guò)的玻璃器皿，在洗滌前必須進(jìn)行嚴(yán)格的消毒。
第一，一般玻璃器皿(如平皿、試管、燒杯、燒瓶等)均可置高壓消毒器內(nèi)在15磅壓力下消毒20～30分鐘。
第二，吸管、載玻片、蓋玻片等可浸泡于5％石炭酸溶液或2％～3％來(lái)蘇兒溶液中浸泡48小時(shí)。浸泡吸管的玻璃筒底部應(yīng)墊以棉花，以防投入吸管時(shí)碰破。

第三，盛有固體培養(yǎng)基(如瓊脂)或沾有油脂(如液體石蠟或凡士林等)的玻璃器皿，應(yīng)于消毒后，隨即趁熱將內(nèi)容物倒凈，用溫水沖洗，再以5％肥皂水煮沸5分鐘，然后以清水反復(fù)沖洗數(shù)次，倒立使之干燥。
3.玻璃器皿的洗滌
第一，將消毒處理過(guò)的玻璃器皿浸泡于洗衣粉水中，用試管毛刷反復(fù)刷去油脂和污垢，然后用自來(lái)水沖洗數(shù)次，最后用蒸餾水沖洗。
第二，經(jīng)清水沖洗后，如發(fā)現(xiàn)玻璃器皿上仍有油跡時(shí)，可放入1％～5％蘇打水或洗衣粉水中煮沸半小時(shí)，再用毛刷刷去油脂和污垢，最后用清水或蒸餾水沖洗干凈。
第三，吸管的洗滌：①將吸管從消毒劑中取出后，先用細(xì)鐵絲取出管口的棉塞。若棉塞太緊不易取出時(shí)，可將鐵絲尖端壓扁，插入棉塞和管壁之間，輕輕一轉(zhuǎn)，即可將棉塞拉出。②將吸管浸泡于5％熱洗衣粉中，在細(xì)鐵絲一端，纏以少許棉花，用以刷洗管內(nèi)的油脂和污垢。③用膠皮管1根，一端接沖棉球，一端接吸管的尖端，在流動(dòng)的清水或自來(lái)水中反復(fù)吸沖數(shù)次，最后用蒸餾水吸沖數(shù)次，倒立于墊有紗布的鐵絲筐或其他容器中。

4.玻璃器皿的干燥
洗凈的玻璃器皿通常倒立于干燥架上，令其自然干燥，必要時(shí)也可放在50℃左右干燥箱中加速干燥。當(dāng)然溫度不宜太高，以免造成破裂。干燥后以干凈的紗布或毛巾擦去水跡，再作進(jìn)一步的處理。
5.玻璃器皿的包裝
玻璃器皿在消毒之前，須包裝妥當(dāng)，以免消毒后又被雜菌所污染。各種玻璃器皿的包裝方法如下：
第一，一般玻璃器皿(試管、三角瓶)的包裝，先做好大小適宜的棉塞或紗布塞，將試管或三角瓶塞好，外面再用紙包扎。燒杯可直接用紙包扎。
第二，吸管先用細(xì)鐵絲或長(zhǎng)針頭塞少許棉花于吸管口端，以免使用時(shí)將病原微生物吸入口中，同時(shí)又可濾過(guò)從口中吹出的空氣。棉花應(yīng)大小適度，以不緊不松為宜。最后將吸管一一分別用紙包裹，再用其他紙每10支包成1束。

第三，平皿、培養(yǎng)扁瓶、青霉素瓶等，用無(wú)油質(zhì)的紙將其單個(gè)或數(shù)個(gè)包成1包，置金屬盒內(nèi)或直接進(jìn)行消毒。
6.載玻片、蓋玻片的處理
用過(guò)的載玻片和蓋玻片，須分別浸泡于2％來(lái)蘇兒或5％石炭酸溶液內(nèi)消毒，經(jīng)48小時(shí)后取出，再放入含5％洗衣粉的水中煮沸30分鐘，用清水沖洗干凈，試干保存，或浸于95％酒精中備用。
7.玻璃器皿用前的消毒
普通玻璃器皿在用前應(yīng)經(jīng)干熱消毒法(160～180℃，1～2小時(shí))消毒，也可用高壓消毒法(15磅壓力下，20～30分鐘)消毒。
8.玻璃器皿云霧狀污垢的處理
凡玻璃器皿上有云霧狀而不能用普通方法洗凈時(shí)，可用清潔液浸泡24小時(shí)，再以清水洗去清潔液，然后用洗衣粉水刷洗干凈為止。若仍洗不凈時(shí)應(yīng)廢棄。清潔液可重復(fù)應(yīng)用多次，直至顏色變?yōu)樗{(lán)綠色或黑色為止。

清潔液的配制：取重鉻酸鉀10克，溶于63毫升常溫清水中，配成重鉻酸鉀飽和溶液。再吸取此溶液35毫升，加入粗質(zhì)濃硫酸1000毫升中即成。
三、細(xì)菌涂片的制備及染色
1.細(xì)菌涂片的制備
(1)玻片準(zhǔn)備：載玻片應(yīng)該清潔、透明而無(wú)油漬，滴上水后，能均勻展開(kāi)。如有殘余油漬，可按下列方法處理：①滴上95％酒精2～3滴，用潔凈紗布擦拭，然后在在酒精燈火焰上輕輕通過(guò)幾次。②若上法仍未能去除油漬，可再滴上1～2滴冰醋酸，再在酒精燈火焰上輕輕通過(guò)。
(2)涂片：①液體材料(如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液)，可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，置于玻片中央，均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層。②固體材料(如菌落、膿、糞便等)，則應(yīng)先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片中央，然后再用來(lái)菌接種環(huán)取少量液體，在液體中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。③組織臟器材料，先用鑷子夾住局部，然后用滅菌的剪刀取1小塊，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓印或涂抹成一薄層。如有多個(gè)樣品同時(shí)需要制成涂片，只要染色方法相同，也可以在同一張玻片上，先用蠟筆劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品。需要保留的標(biāo)本片，應(yīng)貼標(biāo)簽，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

(3)干燥：上述涂片，均應(yīng)讓其自然干燥。
(4)固定：有火焰和化學(xué)兩種固定方法。
①火焰固定：將干燥好的涂片涂面向上，以其背面在酒精燈上來(lái)回通過(guò)數(shù)次，略作加熱固定。
②化學(xué)固定：干燥涂片用甲醇固定。
2.染色
(1)革蘭氏染色：①將已干燥的涂片用火焰固定。②在固定好的涂片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1～2分鐘，水洗。③加革蘭氏碘溶液于涂片上媒染，作用1～3分鐘，水洗。④加95％酒精于涂片上脫色，約30秒鐘，水洗。⑤加稀釋石炭酸復(fù)紅(或沙黃水溶液)復(fù)染10～30秒鐘，水洗。⑥吸干或自然干燥，鏡檢可見(jiàn)：革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

(2)瑞氏染色法:涂片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補(bǔ)充滴加。經(jīng)1～3分鐘再加約與染色液等量的中性蒸餾水或緩沖液，輕輕晃動(dòng)玻片，使與染液混勻。約經(jīng)5分鐘左右，直接用水沖洗(不可先將染液傾去)，吸干或烘干，鏡檢可見(jiàn)：細(xì)菌為藍(lán)色，組織、細(xì)胞等物呈其他顏色。
(3)染色液的制備：
①革蘭氏染色液的配制：
結(jié)晶紫染液：甲液：結(jié)晶紫2克，95％酒精20毫升；乙液：草酸銨0.8克，蒸餾水80毫升。
先將甲液稀釋5倍，加20毫升，再加乙液80毫升，混合即成。此液可較久儲(chǔ)存。革蘭氏碘溶液：碘片1克，碘化鉀2克，蒸餾水300毫升。

先將碘化鉀加入3～5毫升的蒸餾水中溶解后再加碘片，用力搖勻，使碘片完全溶解后再加蒸餾水至足量(直接將碘片與碘化鉀加入蒸餾水中，則碘片不能溶解)。革蘭氏碘溶液不能久藏，1次不宜配制過(guò)多。
復(fù)染劑：番紅(沙黃)復(fù)染液：2.5％番紅純酒精溶液10毫升，蒸餾水90毫升，混合即成。堿性復(fù)紅復(fù)染液：堿性復(fù)紅0.1克，蒸餾水100毫升。
②瑞氏染色液的配制：瑞氏染色劑粉0.1克，純粹白甘油1毫升，中性甲醇60毫升。
置染料于一干凈的乳缽內(nèi)，加甘油后研磨至細(xì)末，再加入甲醇使其溶解。溶解后盛于棕色瓶中，經(jīng)1周后，過(guò)濾，裝于中性的的棕色瓶中，保存暗處。該染色劑保存時(shí)間愈久，染色的色澤愈鮮。

四、病毒的雞胚培養(yǎng)
許多病毒均能在雞胚上發(fā)育繁殖。因此，利用雞胚培養(yǎng)病毒就成為病毒學(xué)上的一種常用的方法，用它可以分離、鑒定某些病毒，制備一些抗原，生產(chǎn)一部分疫苗。
(一)材料與設(shè)備
(1)常選用健康白色雞的受精蛋，通常用產(chǎn)后10天之內(nèi)的新鮮雞蛋。
(2)孵化器可購(gòu)置1具小型孵化器。
(3)檢蛋蛋燈及暗室檢蛋燈分固定及手持式兩種。
①固定式檢蛋燈：為一方形木盒，在底部或一側(cè)裝100W燈泡1個(gè)。上蓋開(kāi)一蛋形孔，周?chē)悦薏蓟蚰z皮，使之適于放置雞蛋而不露光，在暗室中即可檢蛋或定胎位。如無(wú)暗室，用黑布覆蓋檢查者的頭部及木盒，也能檢蛋。

②手持式檢蛋燈：為一有柄圓形筒，內(nèi)裝60W燈泡1個(gè)，筒端口緣包以膠皮，柄上附開(kāi)關(guān)，在暗室中持燈將筒口罩于豎立蛋上，即可觀察胚胎發(fā)育狀況，使用方便。
(4)開(kāi)蛋器市上買(mǎi)的鋼錐或獸用采血針頭，均可用來(lái)鉆孔。牙科磨牙機(jī)或電烙器，可用于開(kāi)蛋窗。
(5)蛋盤(pán)及蛋座蛋盤(pán)為盒形木制，在上層板上開(kāi)略小于雞蛋的圓形或橢圓形孔數(shù)行，圓形孔可豎立放置待檢蛋，橢圓形孔可橫臥放置待檢蛋。定胎位后，接種、解剖及固定培養(yǎng)時(shí)，使用此盤(pán)。
蛋座為小方形木盒，上有圓形或橢圓形孔1個(gè)，供接種或解剖收獲時(shí)用。
(6)接種罩及紫外線燈接種或收獲時(shí)，為了避免污染及傳染，必須在接種罩中操作。罩內(nèi)裝置紫外線燈，以便消毒。

除上述材料與設(shè)備外，還需1～5毫升注射器、膠皮乳頭、無(wú)菌滴管、玻璃紙或電工用透明膠紙、病毒保存液(緩沖甘油液或50％兔血清緩沖鹽水)、滅菌培養(yǎng)皿、乳缽、玻璃研磨器、鑷子、剪子以及各種消毒液(3％碘酊、酒精棉球、3％來(lái)蘇兒)等。
(二)操作技術(shù)
1.雞胚的孵化及檢蛋
將選好的雞蛋，先用溫水洗凈，并用酒精紗布擦拭后，放入37.5～38℃，濕度為45％～60％的孵蛋箱內(nèi)，每日孵蛋2～3次。孵后第四天開(kāi)始用檢蛋燈照視發(fā)育情況，若僅見(jiàn)模糊的蛋黃黑影，無(wú)雞胚跡象，則為未受精蛋；4日后若見(jiàn)清晰血管小團(tuán)，其中有雞胚暗影，較大的雞胚則可見(jiàn)到胚動(dòng)，則為活雞胚；雞胚活動(dòng)呆滯或不能主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，血管昏暗或斷折沉落，則為瀕死或死亡雞胚。

2.雞胚的接種法
包括卵黃囊接種法、絨毛尿囊膜接種法、尿囊接種法、囊膜接種法、靜脈接種法、腦內(nèi)接種法等?，F(xiàn)將絨毛尿囊膜接種法及尿囊接種法介紹如下：
(1)絨毛尿囊膜接種法：
①接種步驟：選用孵化10～12天的雞胚，劃出氣室及絨毛尿囊膜的發(fā)育面，在絨毛尿囊膜處(靠近胚胎而無(wú)大血管處)蛋殼上，用碘酊及酒精消毒后，銼一個(gè)三角形或方形裂痕，除去蛋殼造成“蛋窗”，注意勿傷及蛋殼膜。另在氣室中心鉆小孔，將蛋橫臥于蛋盤(pán)(座)上，在殼膜窗上滴無(wú)菌鹽水1滴，以針尖將蛋殼膜劃破一小孔，不可傷及下面的絨毛尿囊膜，然后用膠皮乳頭置于氣室端之小孔處往外吸氣，使鹽水滲入殼膜與絨毛尿囊膜的裂隙內(nèi)，此時(shí)絨毛尿囊膜即下陷，與殼膜完全分離，而形成人工氣室。以注射器注入0.05毫升病毒液于絨毛尿囊膜表面(應(yīng)于造蛋窗后的1～2小時(shí)接種，否則干燥后不能用)，然后用玻璃紙蓋于蛋窗上，周?chē)恳匀芑氖灻芊?。同時(shí)封閉氣室端小孔。橫臥于蛋盤(pán)上，放在35～37℃溫箱內(nèi)，不能翻動(dòng)。每日自蛋窗檢查1次，如病毒發(fā)育良好，則雞胚通常在48～96小時(shí)內(nèi)死亡。

②收獲方法：將待收獲的雞蛋蛋窗用碘酊消毒，用滅菌鑷子撕掉玻璃紙，擴(kuò)大蛋窗，除去蛋殼膜，輕輕夾起絨毛尿囊膜，用小剪子沿人工氣室周?chē)鷮⒔臃N的絨毛尿囊膜全部剪下，放置在雙碟或玻璃板上，觀察病變。將病變顯著的部分，放入滅菌小瓶?jī)?nèi)保存。
(2)尿囊接種法
①接種步驟：選用孵化10～11天的雞胚經(jīng)照視后，劃出氣室和胎位，在雞胚旁無(wú)大血管處用鉛筆劃一記號(hào)，用碘酊和酒精消毒后，以滅菌鋼錐在接種處鉆一小孔，只破蛋殼而不破殼膜。針頭沒(méi)小孔避開(kāi)雞胚斜向刺入0.5～1.0厘米處，注入0.1～0.2毫升病毒懸液。用石蠟封口后，置溫箱內(nèi)孵化。每日翻蛋兩次，檢查一次。

②直立收獲方法：收獲時(shí)間須根據(jù)所感染病毒種類(lèi)而定。收獲前置冰箱中冰凍一夜，以免解剖時(shí)出血。收獲時(shí)將雞蛋放在蛋架上，用碘酊和酒精將氣室端消毒，用滅菌鑷子除去氣室部蛋殼及蛋殼膜，在絨毛尿囊膜無(wú)大血管處穿破，用吸管吸取尿囊液。每一雞胚約可得尿囊液5～6毫升，貯入小瓶中冰凍保存。??