高效液相色譜法測定飼料中磺胺喹惡啉方法研究

　　磺胺喹惡啉屬磺胺類抗生素兼有抗球蟲作用，廣泛用于養(yǎng)禽業(yè)，其口服后吸收迅速，但排泄緩慢，殘留在組織器官及雞蛋中時間長，人食用后，對人體產(chǎn)生耐藥性等副作用。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定動物組織、奶的最高殘留限量(MRL)值為100μg/kg。日本等國規(guī)定肉雞中不得檢出。因此，該藥的使用應嚴格控制用藥期及用藥量，以保證產(chǎn)品的安全及對外貿(mào)易暢通。

　　據(jù)英國獸藥典記載，磺胺喹惡啉純品為黃色粉末，幾乎無味，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于堿性溶液。目前，飼料中磺胺喹惡啉的檢測方法美國AOAC標準是采用分光光度法，該法要求含阿散酸及不含阿散酸的飼料采用兩種不同的測定方法。而國內(nèi)飼料目前添加組分較復雜，檢測者對飼料情況是未知的，難以確定用哪一個方法；且該方法中需要重氮化試劑做偶合反應，其毒性大，對操作者及環(huán)境 都會造成危害。因此，我們沒有采用該法。另外，還有文獻報道用氣相色譜法測定，中間仍需重氮化衍生。我們最終選用高效液相色譜法。

　　1.測定方法

　　1.1原理 用甲醇水溶液提取飼料中的磺胺喹惡啉，離心，過濾，在HPLC儀上分離,紫外檢測器240nm處測定。

　　1.2 試劑和溶液

　　以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑；水為蒸餾水，色譜用水符合GB/T6682規(guī)定的一級水。

　　1.2.1 磺胺喹惡啉標準品：含磺胺喹惡啉(C14H12N4O2S) 95.0％。

　　1.2.2 甲醇：色譜純。

　　1.2.3 磷酸鹽溶液：取磷酸二氫鉀3.40g和磷酸氫二鉀5.71g，加水溶解并稀釋至1000mL。

　　1.2.4 磺胺喹惡啉標準溶液：準確稱取磺胺喹惡啉(4.1)50mg，溶于甲醇并稀釋成0.1mg/mL的儲備液，置4℃冰箱中避光保存，有效期1個月。臨用前，取此儲備液用水稀釋成適當濃度的標準工作液。

　　1.2.5 提取液：甲醇100mL＋水50mL

　　1.3 儀器

　　1.3.1 實驗室常用儀器設備

　　1.3.2高效液相色譜儀(配紫外檢測器)

　　1.3.3 分析天平：感量為0.0001g和0.001g

　　1.3.4 旋渦振蕩器

　　1.3.5 離心機：4000r/min

　　1.3.6針頭過濾器：備孔徑為0.45μm 微孔濾膜

　　1.4 分析步驟

　　1.4.1 提取

　　稱取5g試樣，精確至0.001g，加入提取液(4.5)50mL，旋渦振蕩器混勻，超聲水浴中提取15min，中間取出搖動1次，然后4000r/min離心5min，靜置，取上清液過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。

　　1.4.2 標準曲線的制備

　　準確吸取儲備液適量，用水或流動相稀釋成濃度分別為0.10、0.50、1.00、2.00、10.0μg/mL的磺胺喹惡啉標準溶液，做出標準曲線。

　　1.4.3 測定

　　1.4.3.1 色譜條件

　　色譜柱：C18柱 柱長150mm，柱內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm或性能相當者。

　　流動相：磷酸鹽溶液75mL＋甲醇25mL，用前過0.45μm濾膜，并超聲脫氣。

　　流速：1mL/min。

　　檢測波長：240nm。

　　進樣量：10～20μL。

　　1.4.3.2 定性與定量

　　根據(jù)標準品的保留時間定性，定量由標準曲線或單點校準。

　　1.4.4 結(jié)果的計算

　　每千克試樣中含磺胺喹惡啉的質(zhì)量按下式公式計算：

　　m1

　　x= — ×D

　　m

　　x——每千克試樣中磺胺喹惡啉的質(zhì)量(mg)；

　　m1——色譜峰面積對應的磺胺喹惡啉的質(zhì)量(μg)；

　　D——稀釋倍數(shù)；

　　m——所稱樣品的質(zhì)量(g)。

　　平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留至小數(shù)點后1位。

　　2.結(jié)果與討論

　　2. 1 色譜條件的確定

　　大多數(shù)磺胺類藥物常以磷酸/乙腈體系做為流動相，而磺胺喹惡啉在該體系下出峰時間是56min，影響檢測效率。改用磷酸鹽/甲醇體系做流動相。

　　通過改變磷酸鹽和甲醇的比例，磺胺喹惡啉的保留時間發(fā)生了變化。

　　磷酸鹽 : 甲醇 磺胺喹惡啉保留時間 (min)

　　70 : 30 4.86

　　75 : 25 7.80

　　80 : 20 12.32

　　出峰早磺胺喹惡啉與雜質(zhì)峰相互干擾，出峰晚影響檢測效率，峰形變寬。磷酸鹽與甲醇比例75:25較為合適。

　　2.2 方法線性與最小檢出限

　　對5.0、10.0、20.0、100.0 mg/kg的添加濃度按上述方法測定。

　　添加濃度(mg/kg) 5.0 10.0 20.0 100.0

　　峰面積 35906 71684 122536 771414

　　線性方程為：y=7821.8～13601.6

　　相關(guān)系數(shù)為：r=0.9992

　　方法最小檢出濃度為5.0mg/kg?；前粪瓙哼氖褂脛┝侩u配合飼料是60g/t，能夠檢出低于用量10倍濃度已能滿足檢測需要。

　　2.3 方法的準確度與精密度

　　根據(jù)磺胺喹惡啉在配合飼料中允許使用量為60 mg/kg，取配合飼料分別制成5、60、100mg/kg的磺胺喹惡啉添加試樣，每個濃度做5個平行，提取，上機測定，計算回收率及方法變異系數(shù)。

　　添加量 實測值 回收率 變異系數(shù)

　　(mg/kg) (mg/kg) (％) (n=5)

　　5 4.5 89.4 6.7

　　60 55.6 92.6 2.1

　　100 95.2 95.2 4.6

　　2.4 適用范圍

　　取添加劑預混合飼料及濃縮料制成添加試樣，提取，適當稀釋上機測定。

　　添加量 實測值 回收率 變異系數(shù)

　　(mg/kg) (mg/kg) (％) (n=5)

　　添加劑預混合飼料 200 190.2 95.1 5.4

　　添加劑預混合飼料 1500 1480.6 98.7 2.1

　　濃縮料 100 91.5 91.5 6.2

　　總之，通過上述實驗考查，說明該方法不僅適用于配合飼料，同樣也適用于濃縮及添加劑預混合飼料。

　　3. 結(jié)論

　　通過上述實驗考查，本方法提取操作簡便、快捷，在此色譜條件下，分辨率高，干擾少，適用于配合飼料、濃縮料及添加劑預混合飼料中磺胺喹惡啉的測定。方法最小檢出濃度滿足實際監(jiān)督檢測需要，具有較好的準確度及精密度。

　　(參考文獻略)

　　（作者：范理 來源：中國飼料工業(yè)信息網(wǎng)）