3.2 小肽飼料價(jià)值指標(biāo)的測(cè)定方法 3.2.1 小肽總含量的測(cè)定方法 3.2.1.1 雙縮脲法 雙縮脲法的原理是利用蛋白質(zhì)和肽分子中含有的肽鍵（CO-NH-）具有雙縮脲反應(yīng)的特性。在堿性溶液中蛋白質(zhì)或肽與Cu2+形成紫紅色的絡(luò)合物，絡(luò)合物顏色的深淺與其濃度成正比。所以它是蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)的特異性測(cè)定方法。雙縮脲法測(cè)定靈敏度不高，一般測(cè)試濃度在1～10 mg/ml之間。此法尤其適合于肽類物質(zhì)的測(cè)定，但只能測(cè)定二肽以上的肽, 造成測(cè)定結(jié)果偏低。對(duì)于小肽來說，雙縮脲法會(huì)把三肽以上的肽也算在小肽里面，因此只適合可以確定飼料中只含有三肽的飼料。 3.2.1.2 福林-酚法（Lowry法） 福林-酚法是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。首先是在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色的絡(luò)合物，然后該絡(luò)合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色溶液。此法適合于蛋白類的定量分析，靈敏度較高，檢測(cè)低限為5 μg，通常測(cè)定范圍在20～250 μg之間，但專一性不強(qiáng)。同雙縮脲法一樣，此法也只適合可以確定飼料中只含有三肽的小肽飼料的檢測(cè)。 3.2.1.3 三氯乙酸（TCA）法 三氯乙酸法的原理是利用大分子的蛋白質(zhì)在TCA溶液中沉淀，除去酸不溶蛋白質(zhì)，然后測(cè)定酸溶蛋白含量。國(guó)外大量資料表明，在蛋白質(zhì)酶水解的研究中測(cè)定水解度，通常在酶解液中加入TCA溶液，使未水解的大分子蛋白質(zhì)沉淀，而與小分子的酸溶蛋白成分，即肽類和FAA離開，測(cè)定酸溶蛋白占總蛋白的含量，求得水解度，即酸溶蛋白占總蛋白的百分比。日本某公司將TCA可溶蛋白做為大豆肽的常規(guī)檢測(cè)方法。大豆肽粉行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中酸溶蛋白質(zhì)的測(cè)定方法就是將肽粉經(jīng)酸沉處理后用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB14771-1993）的方法測(cè)定酸溶蛋白，游離氨基酸含量測(cè)定方法采用GB/T14965食物中氨基酸的測(cè)定方法，酸溶蛋白質(zhì)含量減游離氨基酸含量即為大豆肽含量。 3.2.2 平均肽鏈長(zhǎng)度的測(cè)定 測(cè)定平均肽鏈長(zhǎng)度需要測(cè)定α-氨基氮（α-NH2-N）含量和總氮（TN）含量。用甲醛滴定法測(cè)定α-NH2-N含量，總氮用凱氏定氮法測(cè)定。然后計(jì)算平均肽鏈長(zhǎng)度，公式如下： 3.2.3 特定小肽和氨基酸含量的測(cè)定 3.2.3.1 紫外光吸收法 分子中含有芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸等）的肽，在280 nm處有最大吸收峰。肽在最大吸收峰λmax波長(zhǎng)處的吸光值的強(qiáng)弱與蛋白的濃度成正比。這種方法適合對(duì)分子中含有芳香族氨基酸的肽進(jìn)行定量分析，對(duì)不含芳香族氨基酸的肽靈敏度較低。 3.2.3.2 消光系數(shù)法 分子中含有芳香族氨基酸殘基的肽，在280 nm處有特定吸光值。肽分子中所含氨基酸數(shù)量不同，它們?cè)?80 nm處吸光值的強(qiáng)弱就有差異。因此，每一種純的單一肽在280 nm處有一個(gè)特定的消光系數(shù)。如果已知某個(gè)小肽的消光系數(shù)，只要在280 nm處測(cè)定出該蛋白吸光值就可以計(jì)算出其相應(yīng)的含量。 3.2.3.3 考馬斯亮蘭法（Bradford法） 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其它幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究后人們認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595 nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：①靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高4倍；②測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑，完成一個(gè)樣品的測(cè)定只需要5 min左右；③干擾物質(zhì)少，此法可以用來測(cè)定含堿性氨基酸的肽的含量。 3.2.3.4 層析比色法 通過層析柱將不同分子量的肽或氨基酸一一分開，用比色法測(cè)定其濃度，再采用已知分子量的肽類和氨基酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出一定分子量范圍內(nèi)肽類的含量。該方法與以前的方法相比有很大的進(jìn)步，但基本上仍屬化學(xué)法，操作繁瑣，人為誤差較大。 3.2.3.5 高效凝膠色譜法（HPGC） 該法在層析比色法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了儀器自動(dòng)化的改進(jìn)，準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、數(shù)據(jù)處理科學(xué)，能真實(shí)地表示出蛋白質(zhì)和肽類的分子量分布。分子量分布的測(cè)定不但能定性地鑒定肽類產(chǎn)品的優(yōu)劣、真?zhèn)?，而且能定量的表示出不同分子量范圍的肽的百分含量。?guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)移因子溶液》WS1—XG—036—2000 中，將該方法做為轉(zhuǎn)移因子（一種肽類）的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。 3.2.3.6 高效液相色譜法（HPLC） 高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的重要化學(xué)分離分析手段，是常用的小肽分析方法。高效液相色譜法分為兩種；一種用反相C18柱，用乙睛和0.1% TFA或高氯酸的水溶液進(jìn)行梯度洗脫分離，有的還需加入十二烷基磺酸鈉；另一種是以分離氨基酸的經(jīng)典反相高效液相色譜（HPLC）條件，對(duì)小肽進(jìn)行柱前或柱后衍生化來進(jìn)行測(cè)定。鄒娟娟等研究了反相HPLC 分離分析化學(xué)合成的O8肽的方法。歐宇認(rèn)為HPLC測(cè)定小肽含量簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，結(jié)果穩(wěn)定，可以用來測(cè)定已知小肽在瘤胃中的釋放情況。馮健等使用HPLC法測(cè)定草魚血漿肽和蝦蛋白肽中小肽總量。但是該法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用一般飼料企業(yè)的快速測(cè)定。劉慶生等研究了新型離子色譜的氨基酸分析系統(tǒng)和積分脈沖安培檢測(cè)對(duì)小肽的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此方法無需衍生，可以直接分離測(cè)定小肽和氨基酸，而且操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好，其流動(dòng)相為水、氫氧化鈉和醋酸鈉溶液，有環(huán)境污染小、危險(xiǎn)性小和排放少等優(yōu)點(diǎn)。 3.2.3.7 CE-ESI-MS聯(lián)用法 毛細(xì)管電泳（CE）作為一種高效、快速的分離方法，樣品用量少，已被廣泛應(yīng)用于小肽和蛋白質(zhì)的分離分析。質(zhì)譜（MS）能夠進(jìn)行微量鑒定，并提供精確的分子量和結(jié)構(gòu)信息，使其成為小肽和蛋白質(zhì)檢測(cè)及序列測(cè)定強(qiáng)有力的支撐技術(shù)之一。其中的電噴霧（ESI）質(zhì)譜作為一種軟電離技術(shù)，易與常規(guī)的高分辨率分離方法如高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等實(shí)現(xiàn)在線聯(lián)用，具有分離效率高、檢測(cè)靈敏度高和樣品定性方便等特點(diǎn)，因而在小肽和蛋白質(zhì)的測(cè)定中得到廣泛的應(yīng)用。梁振等研究了CE-ESI-MS聯(lián)用測(cè)定小肽混合物的技術(shù)，其檢測(cè)限可達(dá)4.2~33 pg。 4 總結(jié) 隨著小肽制品商業(yè)化的不斷深入，制定科學(xué)、統(tǒng)一的小肽標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小肽飼料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定已非常必要?？茖W(xué)的測(cè)定方法是小肽標(biāo)準(zhǔn)的制定和使用的保證。明確小肽的概念，了解影響小肽飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的因素是評(píng)定小肽價(jià)值的前提，在此基礎(chǔ)上我們要選擇必要的測(cè)定指標(biāo)，然后篩選相應(yīng)的測(cè)定方法。目前，測(cè)定小肽含量的方法有很多種，但從中發(fā)展出一套科學(xué)有效的測(cè)定方法做為小肽標(biāo)準(zhǔn)的尺度仍是一個(gè)艱難的任務(wù)，有待進(jìn)一步的研究。 |
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