枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物有效磷變化及常規(guī)營養(yǎng)成分的評定

　

　　我國是產(chǎn)棉大國，年產(chǎn)棉籽800余萬噸，榨油后可以生產(chǎn)出棉籽餅粕約400萬噸。新疆作為我國最大的棉花生產(chǎn)基地，其棉花產(chǎn)量約占全國產(chǎn)量的1/3。棉籽餅粕是棉花加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，富含蛋白質(zhì)（30%～45%），是重要的蛋白飼料資源，2007年新疆總產(chǎn)量高達(dá)140多萬噸。棉籽餅粕中不僅含有大量的游離棉酚和環(huán)丙烯脂肪酸，還含有植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了棉粕在飼料生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

　　植酸鹽是棉籽餅粕飼料的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其含量約占棉粕干物質(zhì)的0.84%，植酸的存在會對棉籽餅粕作為飼料的生物學(xué)效價產(chǎn)生一定的影響力。植酸會對動物在自身所必需的礦物質(zhì)吸收利用上產(chǎn)生一系列的阻礙作用，例如引發(fā)動物厭食、消瘦和生長緩慢等病癥；棉籽中的植酸減少了有效磷的利用率；植酸還會影響動物對蛋白質(zhì)的消化利用。飼料中添加植酸酶對提高畜禽業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要意義。

　　枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部公告（第1126號）公布的直接飼喂動物的一種微生態(tài)有益菌種，在其生長繁殖過程中可產(chǎn)生植酸酶；玉米是重要的糧食作物和飼料來源，也是全世界總產(chǎn)量最高的糧食作物。研究以產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌為菌種，以玉米和棉粕組成的棉粕源生物發(fā)酵飼料進(jìn)行發(fā)酵，探究其對棉粕源發(fā)酵飼料中有效磷及常規(guī)營養(yǎng)成分的影響，為開發(fā)棉粕源枯草芽孢桿菌發(fā)酵飼料，微生態(tài)發(fā)酵飼料的科學(xué)評定和合理利用提供理論依據(jù)；為促進(jìn)動物生長、生物發(fā)酵飼料的科學(xué)利用、提高飼料的利用率等提供理論支撐。

　　1　材料與方法

　　棉粕、玉米粉均由新疆石河子天康飼料有限公司提供，粉碎，過60目篩。

　　1.2　菌種及培養(yǎng)基

　　1.2.1　菌種

　　產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌Z3由新疆石河子大學(xué)動物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室選育。

　　1.2.2　營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

　　蛋白胨10gL-1、牛肉膏3gL-1、NaCl5gL-1、瓊脂15gL-1。pH7.0，121℃條件下高壓15min。以下培養(yǎng)基均做同樣處理。用于菌株純化、平板計(jì)數(shù)。

　　1.2.3　植酸酶液體培養(yǎng)基

　　取經(jīng)過60目篩粉碎過的麩皮100g加到900mL水中，121℃處理60min，8層紗布過濾，濾液定容至1L，加入胰蛋白胨10g、（NH4）2SO40.4g、MgSO47H2O0.2g、KH2PO40.05g、K2HPO40.04g、CaCl22g，pH7.0。

　　1.3　種子液培養(yǎng)

　　將枯草芽孢桿菌Z3接入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，挑取1環(huán)菌苔接入20mL（50mL三角瓶）植酸酶液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖動培養(yǎng)15h（一級菌種），取一級菌種1mL接入（150mL三角瓶）WBE培養(yǎng)基50mL，37℃、200rpm搖動培養(yǎng)15h（二級菌種）。

　　1.4　主要儀器和試劑

　　高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3750，日本）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9246MBE，上海）；電熱恒溫水浴鍋（DKB-501A，上海）；722型可見光分光光度計(jì)；離心機(jī)（日立HITACHI），隔水式恒溫培養(yǎng)箱，HH型電熱恒溫水浴鍋。Folin酚試劑、碳酸鈉溶液0.4mol、三氯乙酸（TCA）溶液0.4mol、pH7.2磷酸鹽緩沖液、酪蛋白2%溶液、酪氨酸溶液100gmL-1，均按SB/T1031721999配制。

　　1.5　試驗(yàn)方法

　　1.5.1　底物發(fā)酵處理方法

　　試驗(yàn)組底物處理：將棉粕90g、玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分?jǐn)嚢?，?.056MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后于無菌條件下接入產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌Z3二級種子液7mL，攪拌均勻，三角瓶四層紗布封口，于恒溫培養(yǎng)箱37℃靜止培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物放入烘箱中45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　對照組發(fā)酵底物處理：將試驗(yàn)底物加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分?jǐn)嚢枵{(diào)濕，pH自然，在0.056MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后接入液體培養(yǎng)基（不含菌種）7mL，攪拌均勻，不經(jīng)發(fā)酵，直接將其放入烘箱中，45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)的測定參考楊勝《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。植酸酶活性的測定方法參照GBT：18634-2009進(jìn)行，并做了適當(dāng)修改，酶液用pH5.5的乙酸鈉緩沖液稀釋至103，取1mL于37℃預(yù)熱5min，加入5mmolL-1植酸鈉溶液2mL，37℃反應(yīng)30min，加入顏色終止液2mL，室溫條件下靜置10min后，取上清液3mL于415nm處測定OD值?？瞻讓φ帐菍⒚敢汉徒K止液37℃溫浴30min后再加入底物植酸鈉。植酸酶活性單位定義為樣品在植酸鈉濃度為5mmolL-1、溫度37℃、pH5.5的條件下，植酸鈉中釋放1μmolmin-1無機(jī)磷為1個植酸酶活性單位（U）。植酸含量的測定參照《三氯化鐵比色法測定植酸含量的研究》進(jìn)行測定。植酸磷含量的測定參照《植物飼料中植酸磷的含量及測定》。蛋白酶活性的測定方法為福林法，參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317-1999。液化型淀粉酶的活力單位定義為1h內(nèi)能液化1g淀粉為1g液化型淀粉的酶量，參照馮莉方法。底物中枯草芽孢桿菌含量的測定采用平板計(jì)數(shù)法。

　　試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-wayANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選取LSD法進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

　　2　結(jié)果與分析

　　2.1　發(fā)酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢桿菌數(shù)量的變化

　　發(fā)酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢桿菌菌數(shù)的變化見表1。

　　從表1中可以得出，發(fā)酵前后植酸及植酸酶含量變化規(guī)律為發(fā)酵后植酸含量極顯著降低了6.84%（P<0.01）。說明產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌可以降低發(fā)酵棉粕中植酸的含量，但降解量很少，這與植酸酶活性較低有關(guān)。飼料中枯草芽孢桿菌數(shù)量極顯著增加7.98×107cfug-1（p<0.01）。< p="">

　　表1　發(fā)酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢桿菌菌數(shù)的變化

　　

　　注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母者表示差異不顯著（P>0.05），肩標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著（P<0.05），肩標(biāo)不同大寫字母者表示差異極顯著（p<0.01）。下表同。< p="">

　　2.2　發(fā)酵前后底物中常規(guī)營養(yǎng)成分的變化

　　發(fā)酵前后底物中常規(guī)營養(yǎng)成分的變化見表2。

　　

　　從表2可以看出，發(fā)酵后干物質(zhì)（DM）提高了1.72%（P>0.05），粗蛋白質(zhì)（CP）顯著提高了13.7（P<0.05），粗脂肪（ee）顯著提高了2.95（p<0.05），鈣（ca）極顯著提高了16%（p<0.01），磷（p）極顯著提高了31.8%（p<0.01），粗灰分（ash）含量極顯著降低了4.30%（p<0.01）。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可顯著提高棉粕源飼料中p含量，這與植酸磷的磷被不同程度釋放出來，進(jìn)而提高了飼料中磷含量有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后棉粕源生物蛋白飼料的營養(yǎng)價值都有不同程度提高。< p="">

　　2.3　發(fā)酵前后底物中總磷、植酸磷及有效磷的變化

　　發(fā)酵前后底物中總磷、植酸磷及有效磷的變化見表3。

　　由表3可知，發(fā)酵后底物中總磷極顯著的提高（P<0.01），植酸磷含量顯著降低6.4%（P<0.05），有效磷含量極顯著提高45.5%（P<0.01），植酸磷/總磷顯著降低13.2%（P<0.05），表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的植酸酶可以有效的降解棉粕源飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸及其鹽類（植酸磷），提高棉粕源飼料中有效磷的含量。< p="">

　　表3　發(fā)酵前后底物中總磷、植酸磷及有效磷的變化

　　

　　2.4　發(fā)酵前后底物中酶活性的變化

　　發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性提高103.72Ug-1，淀粉酶提高24.43Ug-1，蛋白酶活性提高23.21Ug-1，差異均極顯著（P<0.01）。< p="">

　　3　討論

　　利用微生物發(fā)酵法發(fā)酵棉粕源飼料，不但可以除去棉粕中的植酸，而且還可以提高棉粕飼料的營養(yǎng)價值，改善棉粕源飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)，同時可以產(chǎn)生多種消化酶及提高發(fā)酵產(chǎn)物的菌群數(shù)量，對提高棉粕源飼料的綜合利用價值具有重要意義。

　　3.1　微生物發(fā)酵棉粕源飼料后常規(guī)營養(yǎng)成分的變化

　　微生物在發(fā)酵中大量繁殖，可將底物中非蛋白氮、無機(jī)氮、碳及抗?fàn)I養(yǎng)子等轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)價值高的菌體蛋白。張慶華等用熱帶假絲酵母菌CA61、擬內(nèi)孢霉菌E02和植物乳桿菌3種菌株混合固態(tài)發(fā)酵棉粕后，粗蛋白質(zhì)含量從30.05%提高到34.50%，棉粕外觀蓬松變軟，氣味芳香。吳偉偉等研究黑曲霉與釀酒酵母混合固態(tài)發(fā)酵棉籽餅粕，真蛋白質(zhì)含量從32.99%提高到42.40%。肖永友等用經(jīng)馴化后的酵母菌Y-619對發(fā)酵棉粕源飼料，發(fā)酵后真蛋白質(zhì)含量提高3.10%。院江等利用由乳酸菌與酵母菌等主要有益菌組成的復(fù)合菌發(fā)酵棉籽殼，CP提高2.29%，中性洗滌纖維（NDF）降低18.21%，酸性洗滌纖維（ADF）降低16.04%，棉籽殼營養(yǎng)價值顯著提高。張文舉等研究表明，利用熱帶假絲酵母菌ZD-3、黑曲霉菌ZD-8對棉籽餅進(jìn)行復(fù)合固體發(fā)酵，棉籽餅底物粗蛋白質(zhì)提高27.83%，粗纖維含量有所降低，其中假絲酵母菌株發(fā)酵棉籽餅，可顯著降低底物中的EE含量（P<0.05）。< p="">

　　本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕源生物飼料，CP提高13.7%，主要原因是微生物生長繁殖過程中消耗底物而導(dǎo)致發(fā)酵物的絕對含量減少和微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量。棉籽餅底物經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，其EE含量提高2.95%，說明在發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌合成一定量的EE。

　　3.2　微生物發(fā)酵棉粕源飼料后酶類、益生菌等含量的變化

　　枯草芽孢桿菌株在其生長繁殖過程中能夠產(chǎn)生淀粉酶、植酸酶、纖維素酶和少量脂肪酶等酶類。金紅春研究證實(shí)，棉粕經(jīng)過發(fā)酵后，淀粉酶活力提高766Ug-1、纖維素酶活力提高494Ug-1、脂肪酶活力提高249Ug-1。徐晶研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后棉粕中蛋白酶含量為664.17Ug-1，淀粉酶為471.73Ug-1，酵母菌為2×106cfug-1，芽孢桿菌為1.3×108cfug-1。邱良偉研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵棉粕中芽抱桿菌和酵母菌總活菌數(shù)可達(dá)4.6×108cfug-1。夏新成等研究了2株酵母和1株霉菌復(fù)合固態(tài)發(fā)酵對棉籽粕脫毒效果及營養(yǎng)價值的影響，結(jié)果表明，蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶活力變化顯著（P<0.05）。王小磊利用復(fù)合菌種對棉粕源飼料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后酵母菌活菌數(shù)達(dá)2.2億g-1（干基），乳酸菌活菌數(shù)達(dá)2.3億g-1（干基），芽孢桿菌達(dá)18.4億g-1（干基）。本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕源生物飼料，發(fā)酵結(jié)束后枯草芽孢桿菌菌數(shù)提高7.98×107cfug-1，發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶、淀粉酶、蛋白酶分別提高103.721ug-1、24.431ug-1、23.21ug-1，差異均極顯著（p<0.01）。< p="">

　　3.3　微生物發(fā)酵棉粕源飼料后有機(jī)磷含量的變化

　　關(guān)于利用植酸酶降解棉粕或棉粕源飼料中植酸的報道較少。劉曉俠等利用植酸酶對棉粕進(jìn)行處理，研究在不同濃度的植酸酶作用下，棉粕中有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化情況，研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶能顯著降低棉粕中的有機(jī)磷含量（P<0.05），提高無機(jī)磷的含量，且在1000Ukg-1時植酸酶最為經(jīng)濟(jì)有效。曹玲等利用微生物植酸酶分別對3種植物性原料（豆粕、玉米蛋白粉、小麥）進(jìn)行酶處理，結(jié)果表明，植酸酶能夠顯著降低3種植物性原料中植酸磷的含量（P<0.05），同時提升有效磷的含量，通過對磷當(dāng)量的分析，以植酸酶組1000Ukg-1最為經(jīng)濟(jì)有效。本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕源飼料，發(fā)酵后底物中總磷極顯著的提高（P<0.01），植酸磷含量顯著降低（P<0.05），有效磷含量極顯著的提高（P<0.01），植酸磷/總磷顯著降低（P<0.05），表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的植酸酶可以有效的降解棉粕源飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸及其鹽類（植酸磷）。< p="">

　　產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌對棉粕源生物飼料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash、NDF的含量略有所降低，棉粕源生物蛋白飼料的營養(yǎng)價值都有不同程度的提高；發(fā)酵后植酸含量降低，總磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，這與植酸酶活性較低有關(guān)；蛋白酶活性較低，這可能與菌株誘變有關(guān)。

　　產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌對棉粕源生物飼料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash含量略有所降低，棉粕源生物蛋白飼料的營養(yǎng)價值都有不同程度的提高；發(fā)酵后植酸含量降低，總磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，這與植酸酶活性較低有關(guān)；蛋白酶活性較低，這可能與菌株誘變有關(guān)。

　　4　結(jié)論

　　利用產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌對棉粕源生物飼料進(jìn)行發(fā)酵，可有效提高飼料的營養(yǎng)價值，降低底物植酸含量，從而對提高飼料蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)等營養(yǎng)的利用率、降低植酸磷對環(huán)境污染，具有一定的生產(chǎn)意義。