在發(fā)酵的角度廓清“后抗生素時代”的含義

葉赫娜蘭.孤城

大家都說“后抗生素時代”，除了歐盟禁抗帶來的畜牧行業(yè)的緊迫外，它的含義還有另一個。n

那就是，在以往（2005-2006以前），發(fā)酵處于抗生素時代?？股貢r代的含義，是指，以抗生素工藝代表最高發(fā)酵技術，引導行業(yè)。以抗生素工藝評價體系為整個發(fā)酵行業(yè)的指導。也即，抗生素發(fā)酵工藝，指導了有機酸（主要檸檬酸）行業(yè)，氨基酸（主要味精）行業(yè)的生產構成體系。
抗生素發(fā)酵，是經典發(fā)酵的代表。

所謂后抗生素時代，指進入分子時代后，工程菌由于自身原因不適應以抗生素發(fā)酵為指導，而自身發(fā)展了一種開發(fā)，生產，和評價體系。工程菌株的高精度控制發(fā)酵，代表了行業(yè)的最高水平。

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后抗生素的時代特點，有點和經典發(fā)酵時代不同，在經典發(fā)酵時代，抗生素工藝技術涵蓋了，指導了整個發(fā)酵行業(yè)，但后抗生素時代，分子技術和工程菌發(fā)酵技術，并不能代表整個行業(yè)。

它與經典發(fā)酵，即抗生素工藝指導下的發(fā)酵，是同時存在的。 這一點，與抗生素時代不同。

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下面，以蛋白表達為例，大致闡述下后抗生素時代的技術過程，然后，再做一下對比。

先闡述大致工藝過程：

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蛋白表達的技術與工藝概述

在分子生物學角度講，找到或合成外源蛋白基因，構建質粒，并導入細胞以表達具有生物活性的折疊正確的蛋白，是一種成熟的常規(guī)技術。目前，包括酶，抗原，抗體，激素，其他小分子調節(jié)蛋白在內的很多蛋白，都已經用這種技術實現了工業(yè)化生產。在具體的工藝選擇上，歷史沿襲習慣和表達體系的選擇，對工藝穩(wěn)定性，成本，有巨大的影響。

目前，常用的蛋白表達系，有3個類別：

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1，大腸桿菌表達系。
大腸桿菌的遺傳背景十分清楚，代謝相對簡單，發(fā)酵副產物少，在不是很嚴格的情況下，是表達蛋白的首選。通過按經驗選擇合適的菌株及合適的質粒，既可以以包涵體的形式得到大量的目標蛋白，又可以在細胞外得到可溶性蛋白，是常見的一種表達系。

2，酵母菌表達系。
用酵母做表達系，理由之一，也是遺傳背景清楚，而且，當蛋白分子量過小，不能形成包涵體時，或蛋白的二硫鍵過多，不易體外復性時，酵母菌就成了合適的選擇。另外，酵母對蛋白也會有一個簡單的修飾，近似于高等動物的蛋白糖基化過程。這樣，在合成在體液中發(fā)揮作用的蛋白，而且，又不能（技術水平限制）用動物細胞時，就可以退而求其次的選用酵母菌表達。一般是用信號肽把蛋白導出細胞，在發(fā)酵液中以可溶性蛋白的形式存在。這也是一個常見的表達系。

3，動物（或說，人的）細胞表達系。
這種情況，在純度或毒性方面有較高要求的產品應用。一般國外產品應用較多，國內還沒有用動物細胞表達蛋白實現商業(yè)化生產的報道。由于技術限制，國內工業(yè)化生產用這個方法目前還有較大難度。

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這3種表達系，各自有自己的優(yōu)缺點。首先，在潛在的毒性影像方面講，由于和真核生物親緣關系太遠，大腸桿菌就最不合適。其次是酵母菌。而在表達量和代謝控制成本上來講，酵母菌和動物細胞又是差強人意的。現在，很多蛋白習慣性的選用酵母菌做表達系，就是因為早期提取蛋白技術低下，而動物細胞培養(yǎng)技術又不過關的原因所致。目前，雖然提取工藝提高了，但作為蛋白這種高附加值產品，運作成本集中在銷售而不是生產，所以，降低生產成本的訴求很低。站在降低開發(fā)難度的角度講，一方面，質粒構建和質粒與菌株的匹配方面依賴大量經驗，另一方面，發(fā)酵工藝策略選擇與發(fā)酵工藝優(yōu)化又需要很大的投入，所以，技術開發(fā)部門沿用自己熟悉的，已經積累了大量經驗的表達系，是合理的。

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不過，隨著分子技術進一步的發(fā)展，分子技術進入低附加值的產品領域又是必然的，降低生產成本就變的越來越必要了。

大腸桿菌表達系有兩種得到外源蛋白的方法：

1，緩慢的表達，得到可溶性蛋白，這種方法產量和酵母菌表達類似，與酵母菌比，不具有明顯的優(yōu)勢，一般是有做大腸桿菌傳統(tǒng)的研究機構生產小分子蛋白的一種沿襲性做法。

2，使用T7啟動子表達蛋白，這樣，高速的蛋白表達速率使蛋白來不及折疊，在細胞內形成非水溶性的包涵體。最后目標蛋白可以達到總細胞質量的15%-25%，這樣，就為降低成本提供了一種可能。

不過，在使用T7啟動子表達時，也存在兩個難點：

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1，蛋白的復性技術，如果形成可溶性蛋白，那利用（使用分子技術加載在目標蛋白上）信號肽，只要過一遍柱子就能分離得到純度非常高的，具有生物活性的產品，而形成包涵體，對提取，復性就有較高的要求，特別是二硫鍵的存在，會對復性產生很大的影響。在目前國內和國際流行技術看，并不是所有的蛋白都能在預定成本下復性的。

2，任何情況下，高產都是代謝網絡互相依賴與作用的結果。在如此高的表達量下，甚至細胞的形態(tài)都已經發(fā)生很大變化，正常代謝受到嚴重干擾，以至于放大時，搖瓶工藝對發(fā)酵工藝幾乎沒有任何參考價值。發(fā)酵工藝策略的選擇將直接依賴于工程人員在生化，生理水平對菌株的理解，而匱乏可資參考的數據資料。發(fā)酵工藝的優(yōu)化要離開搖瓶經驗在發(fā)酵罐上逐步進行，這樣，整個發(fā)酵工藝的確立就需要比想象中要大得多的人員與時間的投入。

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另外，再說一下糖基化的問題。

在動物細胞內合成的折疊正確的蛋白，在分泌入體液前會有一個糖基化的過程，加上一個糖鏈就不會很快被蛋白酶當做折疊錯誤的蛋白水解掉。但是以微生物為表達系表達的蛋白，不具有動物細胞的修飾過程，用大腸桿菌表達的目標蛋白，很快會在血液中被降解。解決或回避這個問題，有兩種方法：

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1，用動物細胞表達，一般，是用癌化的人類細胞。由于動物細胞培養(yǎng)技術要求過高，在國外比較昂貴的醫(yī)藥中有應用，國內不常見。

2，由于酵母菌也有一個對蛋白的粗略的修飾過程，可以用酵母菌表達目標蛋白。這個技術，國內國外都在用，可以是一個權宜之計。主要難點集中在對合適菌株的分子水平的改造，以達到盡可能接近滿意的修飾效果。