在發(fā)酵的角度廓清“后抗生素時代”的含義

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-5-17 21:59:10

這樣，就可以在不同目標蛋白上表達系和發(fā)酵工藝上做出選擇。如果是小分子，無糖基化修飾或不在體液中發(fā)揮作用的蛋白，可以選擇大腸桿菌和酵母菌表達系，得到可溶性蛋白，然后提取。如果分子量合適，并對生產(chǎn)成本有訴求，而且可以比較方便的復性，則選用大腸桿菌表達系，得到包涵體，然后復性。如果是需要在體液中發(fā)揮活性并有糖基化要求的蛋白，則選用經(jīng)過分子生物學改造的酵母菌表達系。

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-5-17 22:01:17

下面，以溶菌酶為例，闡述一下蛋白表達系的選擇和工藝的確定。

溶菌酶是一類具有種屬差異的非特異性免疫物質(zhì)，在動物界中普遍存在，種類繁多，其實，在植物和微生物中也有發(fā)現(xiàn)。但研究最多的還是動物。開發(fā)獸用溶菌酶，主要是想作為抗生素的替代物，作為添加劑使用。因此是一個低附加值的產(chǎn)品。下面一切的工作，都會圍繞“獸用”和“低附加值”展開。

首先，我們比較了幾種常見和認為有效的溶菌酶，我們發(fā)現(xiàn)，殺菌效果最好的是人的溶菌酶，但考慮到潛在的危險（具有對人溶菌酶產(chǎn)生抗性，并使抗性基因擴散），我們舍爾求其次，用了鳥類蛋清溶菌酶，作為表達對象。

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-5-17 22:02:44

然后，在得到溶菌酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)后，我們對此進行了分析。此蛋白不會用于體液內(nèi)，故沒有糖鏈修飾的問題。分子量不是很大，但也不太小，130左右的氨基酸構(gòu)成，足以形成包涵體，這就為用大腸桿菌表達系高效表達提供了可能。討厭的是有4個二硫鍵，其中有兩個在結(jié)構(gòu)復雜區(qū)域，折疊正確有一定的困難。但是，如果用酵母菌做，可能沒法解決成本問題，即便優(yōu)化工藝現(xiàn)在過去了，也不會是最終版本----肯定會有人用大腸桿菌做。所以，結(jié)論就是必須知難而進，拿下復性工藝。

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-5-17 22:03:59

另外，由于是低附加值產(chǎn)品，發(fā)酵噸位就不能太小。以往分子生物學流行的50升，100升小罐發(fā)酵，肯定是不行的。發(fā)酵罐的放大，除了溶氧，剪切力發(fā)生變化，更重要的是攪拌線速度改變了胞外酶以及包括細胞本身的代謝方式和速度。在胞內(nèi)體現(xiàn)就是氧化還原電勢的改變，這在工藝上會帶來很多麻煩。雖然說，一般是放大后產(chǎn)量往往提高，但放大過程中，小罐的經(jīng)驗就不能照搬了。同時，也因為是低附加值產(chǎn)品，發(fā)酵過程中諸如質(zhì)粒丟失等穩(wěn)定性要求，就很高了，應為只有穩(wěn)定，才能控制成本。這樣，工藝就成了第二個難點。

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-5-17 22:05:27

明白這些之后，我們按照大腸桿菌的喜好，合成了溶菌酶的基因。然后構(gòu)建質(zhì)粒，導入細胞。在搖瓶水平表達溶菌酶。在篩選復性條件的同時，我們就同時在發(fā)酵罐水平對工藝穩(wěn)定性進行了優(yōu)化。

首先，為了進一步提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，我們對初始培養(yǎng)基進行了重新設(shè)計。并改動發(fā)酵工藝策略，由于是胞內(nèi)產(chǎn)物，我們應用高細胞密度發(fā)酵控制法延長限制性生長時間（不能用經(jīng)典發(fā)酵的延長對數(shù)期生長時間的辦法，對工程菌不適合，會造成質(zhì)粒丟失，代謝紊亂等一系列問題），提高細胞量，并改變了誘導時機，得到了穩(wěn)定的高產(chǎn)，具體數(shù)據(jù)比較枯燥，就不在此展開了。

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-5-17 22:06:45

提取方面，經(jīng)過不懈的努力，我們也掌握了比較成功的復性條件（具體由另外人員負責，也不做詳細介紹了）。這樣，工藝才基本拼湊好。進一步優(yōu)化，在試生產(chǎn)多次重復時在進行。

以上，是外源蛋白表達的粗略的一個技術(shù)和工藝的過程。

葉赫娜蘭-孤城于 2009-6-2 09:10 補充以下內(nèi)容

沒人回，自己回。

很無聊的，但該補充的還是補充下，萬一有人看呢？

還有兩個表達系,也比較常用：乳酸菌和芽孢桿菌。都是細菌。

孟俊英 · 發(fā)表于 2009-7-3 19:33:43

看過了，一氣呵成。你的這些太專業(yè)了，我還要好好轉(zhuǎn)化一下。:)3:畜牧微生物學雖然是畜牧業(yè)的一個重要分枝，但做酸奶、乳酪的工藝流程才是核心，不過溶菌酶的研發(fā)關(guān)乎今后的飼料養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，希望你堅持下去，同道會越來越多的。

葉赫娜蘭.孤城 · 發(fā)表于 2009-7-4 11:12:03

謝謝俊英君的鼓勵。

現(xiàn)在還是有些困難的，真做工藝了，在設(shè)備擴大和選型，物料平衡等一些常規(guī)問題上，遇到阻力。--主要還是成本，在這個壓力下，有可能重新回到工程菌構(gòu)建上，重新設(shè)計構(gòu)建方案，重新開始。

做抗生素出身，雖然作過研發(fā)和生產(chǎn)，對成本還是大意了。慚愧:liuhan:

好在是小試，損失還談不上。嘿嘿。

東方龍 · 發(fā)表于 2009-7-5 00:28:06

21世紀是基因工程的時代，我堅信這一天遲早要到來，基因工程，發(fā)酵工程，蛋白（酶）工程，細胞工程。真正意義上的分子時代

東方龍于 2009-7-5 00:29 補充以下內(nèi)容

溶菌酶也是好東西，我更堅信。因為我一直在堅持使用?。。。。。。。?！

kltdzhong · 發(fā)表于 2009-7-5 02:41:29

隨著技術(shù)的進步應該會代替抗生素吧。