在發(fā)酵的角度廓清“后抗生素時(shí)代”的含義

葉赫娜蘭.孤城

這樣，就可以在不同目標(biāo)蛋白上表達(dá)系和發(fā)酵工藝上做出選擇。如果是小分子，無糖基化修飾或不在體液中發(fā)揮作用的蛋白，可以選擇大腸桿菌和酵母菌表達(dá)系，得到可溶性蛋白，然后提取。如果分子量合適，并對生產(chǎn)成本有訴求，而且可以比較方便的復(fù)性，則選用大腸桿菌表達(dá)系，得到包涵體，然后復(fù)性。如果是需要在體液中發(fā)揮活性并有糖基化要求的 蛋白，則選用經(jīng)過分子生物學(xué)改造的酵母菌表達(dá)系。

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下面，以溶菌酶為例，闡述一下蛋白表達(dá)系的選擇和工藝的確定。

溶菌酶是一類具有種屬差異的非特異性免疫物質(zhì)，在動物界中普遍存在，種類繁多，其實(shí)，在植物和微生物中也有發(fā)現(xiàn)。但研究最多的還是動物。開發(fā)獸用溶菌酶，主要是想作為抗生素的替代物，作為添加劑使用。因此是一個(gè)低附加值的產(chǎn)品。下面一切的工作，都會圍繞“獸用”和“低附加值”展開。

首先，我們比較了幾種常見和認(rèn)為有效的溶菌酶，我們發(fā)現(xiàn)，殺菌效果最好的是人的溶菌酶，但考慮到潛在的危險(xiǎn)（具有對人溶菌酶產(chǎn)生抗性，并使抗性基因擴(kuò)散），我們舍爾求其次，用了鳥類蛋清溶菌酶，作為表達(dá)對象。

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然后，在得到溶菌酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)后，我們對此進(jìn)行了分析。此蛋白不會用于體液內(nèi)，故沒有糖鏈修飾的問題。分子量不是很大，但也不太小，130左右的氨基酸構(gòu)成，足以形成包涵體，這就為用大腸桿菌表達(dá)系高效表達(dá)提供了可能。討厭的是有4個(gè)二硫鍵，其中有兩個(gè)在結(jié)構(gòu)復(fù)雜區(qū)域，折疊正確有一定的困難。但是，如果用酵母菌做，可能沒法解決成本問題，即便優(yōu)化工藝現(xiàn)在過去了，也不會是最終版本----肯定會有人用大腸桿菌做。所以，結(jié)論就是必須知難而進(jìn)，拿下復(fù)性工藝。

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另外，由于是低附加值產(chǎn)品，發(fā)酵噸位就不能太小。以往分子生物學(xué)流行的50升，100升小罐發(fā)酵，肯定是不行的。發(fā)酵罐的放大，除了溶氧，剪切力發(fā)生變化，更重要的是攪拌線速度改變了胞外酶以及包括細(xì)胞本身的代謝方式和速度。在胞內(nèi)體現(xiàn)就是氧化還原電勢的改變，這在工藝上會帶來很多麻煩。雖然說，一般是放大后產(chǎn)量往往提高，但放大過程中，小罐的經(jīng)驗(yàn)就不能照搬了。同時(shí)，也因?yàn)槭堑透郊又诞a(chǎn)品，發(fā)酵過程中諸如質(zhì)粒丟失等穩(wěn)定性要求，就很高了，應(yīng)為只有穩(wěn)定，才能控制成本。這樣，工藝就成了第二個(gè)難點(diǎn)。

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明白這些之后，我們按照大腸桿菌的喜好，合成了溶菌酶的基因。然后構(gòu)建質(zhì)粒，導(dǎo)入細(xì)胞。在搖瓶水平表達(dá)溶菌酶。在篩選復(fù)性條件的同時(shí)，我們就同時(shí)在發(fā)酵罐水平對工藝穩(wěn)定性進(jìn)行了優(yōu)化。

首先，為了進(jìn)一步提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，我們對初始培養(yǎng)基進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)。并改動發(fā)酵工藝策略，由于是胞內(nèi)產(chǎn)物，我們應(yīng)用高細(xì)胞密度發(fā)酵控制法延長限制性生長時(shí)間（不能用經(jīng)典發(fā)酵的延長對數(shù)期生長時(shí)間的辦法，對工程菌不適合，會造成質(zhì)粒丟失，代謝紊亂等一系列問題），提高細(xì)胞量，并改變了誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，得到了穩(wěn)定的高產(chǎn)，具體數(shù)據(jù)比較枯燥，就不在此展開了。

葉赫娜蘭.孤城

提取方面，經(jīng)過不懈的努力，我們也掌握了比較成功的復(fù)性條件（具體由另外人員負(fù)責(zé)，也不做詳細(xì)介紹了）。這樣，工藝才基本拼湊好。進(jìn)一步優(yōu)化，在試生產(chǎn)多次重復(fù)時(shí)在進(jìn)行。

以上，是外源蛋白表達(dá)的粗略的一個(gè)技術(shù)和工藝的過程。

葉赫娜蘭-孤城 于 2009-6-2 09:10 補(bǔ)充以下內(nèi)容

沒人回，自己回。

很無聊的，但該補(bǔ)充的還是補(bǔ)充下，萬一有人看呢？

還有兩個(gè)表達(dá)系,也比較常用：乳酸菌和芽孢桿菌。都是細(xì)菌。

孟俊英

看過了，一氣呵成。你的這些太專業(yè)了，我還要好好轉(zhuǎn)化一下。:)3:畜牧微生物學(xué)雖然是畜牧業(yè)的一個(gè)重要分枝，但做酸奶、乳酪的工藝流程才是核心，不過溶菌酶的研發(fā)關(guān)乎今后的飼料養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，希望你堅(jiān)持下去，同道會越來越多的。

葉赫娜蘭.孤城

謝謝俊英君的鼓勵。

現(xiàn)在還是有些困難的，真做工藝了，在設(shè)備擴(kuò)大和選型，物料平衡等一些常規(guī)問題上，遇到阻力。--主要還是成本，在這個(gè)壓力下，有可能重新回到工程菌構(gòu)建上，重新設(shè)計(jì)構(gòu)建方案，重新開始。

做抗生素出身，雖然作過研發(fā)和生產(chǎn)，對成本還是大意了。慚愧:liuhan:

好在是小試，損失還談不上。嘿嘿。

東方龍

21世紀(jì)是基因工程的時(shí)代，我堅(jiān)信這一天遲早要到來，基因工程，發(fā)酵工程，蛋白（酶）工程，細(xì)胞工程。真正意義上的分子時(shí)代

東方龍 于 2009-7-5 00:29 補(bǔ)充以下內(nèi)容

溶菌酶也是好東西，我更堅(jiān)信。因?yàn)槲乙恢痹趫?jiān)持使用?。。。。。。。?！

kltdzhong

隨著技術(shù)的進(jìn)步應(yīng)該會代替抗生素吧。