介導鋅和銅吸收、利用的載體

007畜牧

　　摘要  
       載體被發(fā)現(xiàn)前，人們認為哺乳動物體內的鋅和銅是以陰離子復合物的形式協(xié)同運輸，比如金屬離子與一個氨基酸結合形成螯合物或與轉鐵蛋白等受體結合。1995 年，第一個鋅離子載體 (ZnT) 基因 ZnT1 在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)。 現(xiàn)在人們認為有兩個蛋白家族參與鋅的轉運。ZnT 蛋白家族促進胞內鋅外流或內流入胞內小囊泡，降低胞內鋅濃度。 ZnT蛋白逆濃度梯度轉運鋅的機制尚不明確，然而，只有ZnT1是位于質膜上，它在動物組織中以多種方式參與鋅的轉運。 我們實驗室發(fā)現(xiàn)，在藥理鋅濃度下，ZnT1 與金屬硫蛋白的鋅轉運機制相同。第二個是 Zip 蛋白家族，介導細胞外液或 細胞內小囊泡中的鋅轉運進入細胞質中，但這種蛋白卻沒有在家畜中發(fā)現(xiàn)。目前，尚未找到合適的指標來評價體內 銅的狀態(tài)。然而，隨著近年來銅載體和伴侶蛋白的發(fā)現(xiàn)，研究人員認為，銅運輸?shù)恼{節(jié)依賴于后翻譯機制介導的調 節(jié)位點蛋白結構的改變。銅載體 Ctr1 和 Ctr3，調控銅吸收的高親和力位點。在人類的肝臟中發(fā)現(xiàn)一種小分子胞質蛋 白 MURR1，但其在銅代謝中的作用機理尚不清楚。銅伴侶蛋白可促進蛋白對銅的吸收，這可能成為衡量銅狀態(tài)的一 個合適的指標。研究證實，適量的高鋅日糧誘導缺銅大鼠，這些大鼠組織內的 Cu/Zn 超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白 (CCS) 含量增加，我們最近在仔豬體內也發(fā)現(xiàn) CCS。其他已證明的銅伴侶蛋白包括 COX17 和 Atox1，與 CCS 相同，他們與細 胞內的 apo- 酶對銅的利用有關。這些分子領域的新發(fā)現(xiàn)，對于評估家畜銅、鋅的生物利用率和營養(yǎng)需要非常必要。
　　中圖分類號 ：S816.72文獻標識碼 ：A文章編號 ：1006-6314(2013)08-0050-04
　　

      1 引言
　　一百多年前，人們就認識到微量元素對家畜生產的重要性，根據微量元素需要量的評估結果，設計日糧配方，最大限度發(fā)揮畜禽的生產性能。近年來，隨著有機礦物的出現(xiàn)，人們越來越關注環(huán)境污染以及飼料成本的增加，微量元素吸收和利用的相關問題也日益顯現(xiàn)。微量元素的來源與質量，對于動物能否有效利用和是否產生外源污染非常重要。我們更多關注的是無機微量元素引起的環(huán)境污染，而不僅僅是按標準添加。
　　

      2 改變的原因
　　礦物質在動物肝臟或骨骼的儲量并不代表動物的代謝需要量，Bobilya 等 1994 年的研究結果很好地證明了這個觀點。他們通過骨活組織檢查發(fā)現(xiàn)，缺鋅導致仔豬生長受阻，但其骨鋅含量卻高達 27mg/kg。這個經典的試驗告訴我們，動物組織中被吸收的微量元素，并不能完全被利用。雖然組織礦物濃度測定在 1960年和 1970 年取得了一定的進展，但酶活性依舊是評估礦物代謝率和狀況的有效指標。Dell(1997) 將生物利用 率定為 ：用生理生化功能的礦物元 素占動物總吸收量的比例。因此，20世紀末對無機微量元素生物利用率的 定義是基于酶活性、生長性能、營養(yǎng) 平衡和肝儲。Hollis 等 (2005) 利用生 長性能評估鋅生物利用率的研究就是 一個很好的例子，他們通過研究藥理 濃度鋅對生長的影響，來比較不同形 式鋅的生物利用率。Rincker等(2005)發(fā)現(xiàn)，乳豬飼喂 2,000mg/kg 的氧 化鋅或蛋氨酸鋅，排泄物中鋅含量不 同，其中蛋氨酸鋅組尿中鋅含量更高， 這表明蛋氨酸鋅組的鋅吸收率更高， 而在肝中鋅含量卻沒有差異。更重要 的是，這個研究還清晰地表明，乳豬 必須在飼喂試驗日糧 10 ～ 14d 后， 糞中的鋅含量才會增加。因此，在試 驗期的不同時間段測定的肝臟鋅濃度 差異很大。Hambridge(2003) 重復了 上述試驗，他發(fā)現(xiàn)除硒以外，血漿或 血清中許多微量元素的濃度并不能作 為一個合適的生物標記，反映機體微 量元素的狀況。由于許多微量元素在 動物血漿、血清和肝臟中的濃度會在 急性反應期內升高或降低，因此經常 會干擾血漿或血漿中的礦物含量的正 常測定，得到錯誤的結果。
　　自從 Hill 和 Spears(2000) 關于 豬的微量和超微量元素的報道發(fā)表以 來，又出現(xiàn)了許多關于微量元素在體 內應用的分子水平上的研究成果。真 核細胞，轉基因小鼠 ( 如敲除小鼠 )和先天性代謝異常的人等都給了科學家應用分子生物學研究的素材。研 究人員認為，蛋白的調節(jié)存在多級水 平，他們假設金屬應答轉錄因子存在(Rutherford and Bird,2004)。盡管在嚙齒目哺乳動物上已經進行了許多類似的研究，但在非嚙齒目動物如家畜上的研究還比較少。
　　
     3 鋅載體
　　Cousins 等 (2006) 在短篇綜述中提到，3% ～ 10% 的人類蛋白基因組含有鋅結合區(qū)。因此，為了健康和長壽，必須保持鋅的內穩(wěn)態(tài)。在組織器官水平，這種穩(wěn)態(tài)依賴于腸道對鋅吸收的調節(jié)以及胰腺和腸道分泌物中鋅的轉運。而在細胞水平，鋅濃度的調節(jié)方面則依賴于吸收、分泌和重分配，甚至是螯合。因此，鋅的轉運對于生命至關重要。
　　

      4 ZnT
　　1995 年，Palmiter 和 Findley 發(fā)現(xiàn)第一個鋅轉運蛋白 ZnT1。在這之前，人們認為鋅在體內是通過陰離子、氨基酸復合物或螯合物、轉鐵蛋白受體來轉運。ZnT1 蛋白家族被認為是溶質聯(lián)合載體家族 (SLC30) 的一個分支。ZnT1 通過介導胞內鋅流出細胞外或流入胞內小囊泡來降低胞內鋅濃度。盡管載體轉運機制尚不明確，但Chimienti 等 (2004) 發(fā)現(xiàn)，人類 ZnT1蛋白存在很大的同源性。在人類細胞、酵母菌、蛙卵母細胞中已發(fā)現(xiàn) 10 個這樣的蛋白家族。這些蛋白家族的蛋白序列各不相同，但除 ZnT5 含有 12個跨膜區(qū)以外，其余家族都含有 6 個跨膜區(qū)，而其中 4 個區(qū)域都有一個鋅移位的通道。另外，序列同源性表明，細胞膜內側的氮端和碳端以及由幾個組氨酸殘基組成的胞內環(huán)，是細胞內鋅轉移的主要調節(jié)因子。
　　雖然大多數(shù)的 ZnT 蛋白存在于胞內細胞器中，如高爾基體或內質網，但 Cousins 等 (2006) 報道，ZnT1 定位于質膜，ZnT2 定位于胰腺腺泡細胞中，ZnT5 存在于胰腺 β-細胞的分泌小囊泡中和腸細胞頂膜上，在有絲分裂細胞的胞核內發(fā)現(xiàn)了ZnT9 蛋白。采用免疫組織化學分析法，Yu 等 (2007) 在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，ZnT1 基因在胃腸道部分 ( 如食道、十二指腸，盲腸等 ) 上皮細胞表達，而 ZnT4 主要是在大腸中表達，ZnT6 蛋白在胃、空腸、盲腸、結腸和直腸中都有發(fā)現(xiàn)，ZnT7 蛋白在胃腸道的各部分都有表達，在小腸中最多。機體一定濃度的鋅對胚胎和胎兒的生長非常重要，那么在胎盤發(fā)現(xiàn)ZnT 就不奇怪了。Helston 等 (2007)報道，小鼠胎盤 ZnT 的表達對日糧鋅含量非常敏感，當日糧鋅含量低于或 3 倍高于需要量時，金屬硫蛋白(Mt)，ZnT1 和 ZnT4 的轉錄蛋白濃度降低。在人類絨毛合體滋養(yǎng)層細胞中，也發(fā)現(xiàn) ZnT1 和 ZnT5。
　　

      5 Zip
　　Zip 是哺乳動物 SLC39 家族成員，主要與鋅的轉運活性有關，包括 Zip1 到 Zip8 和 Zip14。它們在鋅吸收中的主要作用是推動鋅順濃度梯度的運輸，不需要 ATP 參與。盡管Zip 蛋白對鋅的轉運具有特異性，但他們也會被其他一些陽離子抑制。大多數(shù) Zip 蛋白都有 8 個跨膜區(qū)域，他們的氮端和碳端在細胞外側，胞內含有一個很長的由組氨酸殘基組成的內環(huán)。而不同的是，Zip14 的組氨酸環(huán)在胞外側 (Cousins 等 ,2006)。
　　大多數(shù) Zip 蛋白定位于質膜，但Zip7 卻在高爾基體上。Zip 能夠根據鋅的有效含量和生理狀況發(fā)生改變，以發(fā)揮功能。當鋅利用受限，腸上皮細胞質膜上的轉運蛋白 Zip4 增加，而當鋅恢復，基底層 Zip4 蛋白的表達減少 (Cousins 等 ,2006)。Zip1 蛋白增加急性反應期肝細胞對鋅的吸收，因此，Zip 基因的表達受日糧鋅含量的調控，Zip 蛋白的出現(xiàn)，可能對家畜鋅利用的調控非常關鍵，但目前關于 Zip 家族在畜禽中研究的報道較少。
　　

      6 載體調節(jié)和 Mt
　　當日糧含鋅量不同時，ZnT1 在不同組織中的調控是不同的，主要表現(xiàn)在金屬敏感轉錄因子 1 和 mRNA的豐度。我們實驗室 (Martinez,2004)發(fā)現(xiàn)，無論在仔豬日糧中是否添加植酸酶，1,000mg/kg 鋅日糧組肝臟中ZnT1 蛋白的表達都大于 2,000mg/kg 組。而有趣的是，Mt 蛋白在試驗 豬腸黏膜中的表達卻沒有發(fā)現(xiàn)這種 現(xiàn)象，2,000mg/kg 鋅( 以 ZnO 中Zn 計 )+ 植酸酶組腸黏膜 Mt 含量 極顯著高于2,000mg/kg鋅-植酸酶 組，而且，2,000mg/kg 鋅 - 植酸酶組Mt含量極顯著高于 1,000mg/kg鋅 + 植酸酶組。這提示我們，當給 保育豬飼喂藥理濃度的鋅，ZnT1 和 Mt 都參與了體內鋅平衡的調節(jié)。在 另一個研究中，給保育豬分別飼喂100、1,000 和 4,000mg/kg 的鋅，1,000 和 4,000mg/kg 組十二指腸 黏膜細胞中 Mt 蛋白含量極顯著高于100mg/kg 組，而1,000mg/kg 和 4,000mg/kg 組沒有差異 ；然而，在空腸段，兩個高鋅組總鋅吸收量增加但單位腸表面積的鋅含量卻下降，4,000mg/kg 鋅組 Mt 蛋白含量極顯著高于 1,000mg/kg 或 100mg/kg鋅組 (Martinez et al.,2005)。假設 十二指腸內的 Mt 蛋白通過從空腸細胞中脫落，降低了空腸吸收的鋅的可利用率，從而導致空腸鋅含量的差異。在空腸中，隨著結合 Mt 中鋅的量的減少，大量的鋅與肝臟中的Mt 結合，導致激發(fā) ZnT1 生成的可用鋅含量降低。
　　

    7轉銅載體
　　細胞生物， 人類代謝性疾病和分子生物學技術研究人員闡明 了動物體內銅代謝的規(guī)律。如肝豆核變性病人體內銅的蓄積異常，而門克斯病患者則是伴 X 染色體銅 代 謝紊亂， 由于銅轉運蛋白缺乏，導致銅在不同器官內缺乏或蓄積 (Hill 等,1987;Cater 和Mercer,2005;Vonk 等 ,2008)。門 克斯病患者表現(xiàn)為頭發(fā)和皮膚的功缺失，生長發(fā)育遲緩，神經機障礙，結締組織異常 (Cater 和Mercer,2005)。肝豆核變性患者表現(xiàn) 為肝功異常，神經機能障礙，或兩者 皆而有之，可能會死于紅細胞不完 整 (Hill 等 ,1987)。伯靈頓更病也是 一種銅代謝紊亂的遺傳疾病。作為一 種營養(yǎng)需要，銅在體內存在是有矛盾 的，因為它是以二價氧化還原態(tài)形式 存在，可以通過接受或供給電子改變 價態(tài)。因此，像鐵一樣，為了防止芬 頓反應產生自由基，銅必須與蛋白結 合。最重要的是，銅在體內的含量以 及在細胞中的傳遞必須被精密調控和 管理。銅的吸收主要是在十二指腸段， 從刷狀緣轉移到腸上皮細胞 (Cater和 Mercer,2005)。然而，腸黏膜上的 這些特殊細胞端吸收銅的機制尚不明 確。兩個相關蛋白分別是 ：①高親和 力的銅轉運蛋白 (Ctr1)，一種普遍表 達的跨膜蛋白。②刷狀緣上的二價金 屬轉運蛋白 (DMT1)，也叫 nramp。
　　

      8DMT1
　　已知 DMT1 與 細 胞 Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+ 的吸收有關。然而，當銅不足或其他微量元素缺乏時，DMT1 不參與銅吸收的調節(jié) (Cater和 Mercer,2005)。
　　
      9 Ctr1
　　Ctr1 蛋白使銅轉運入細胞成為可能 (Zhou 和 Gitschier,1997)。Ctr1含有富含組氨酸和蛋氨酸殘基的三 個銅結合跨膜區(qū)，有證據表明，Ctr1蛋白還構成一個銅離子通道。因此， 當銅超量時，Ctr1 通過介導質膜內 陷或降解內涵體調節(jié)體內銅含量。經 檢測，Ctr1 基因在所有組織中都存 在，其中以肝臟中含量最豐富 (Cater和 Mercer,2005)。這與肝細胞需銅理論相符，因為肝臟具有很強的代 謝作用。Ctr1 以 Cu2+ 形式將銅傳遞給細胞，又以一種未知的機制將銅 以Cu1+ 形式轉移給伴侶蛋白。正如Field 等 (2002) 描述，為了將銅合成金屬酶，生物體演化出一組胞內銅結 合蛋白家族，形成一個用于合成金屬 酶的可用銅儲備庫，直接將銅離子轉 運到適當?shù)陌衅鞴佟?br /> 　　

     10 COX17
　　據統(tǒng)計，已確定有 3 個伴侶蛋白， 機體可能通過將銅轉運入這些小分子 蛋白，調節(jié)銅在各組織結構中的數(shù)量 和位點，發(fā)揮功能。細胞色素c氧化 酶銅伴侶蛋白 (COX17) 將銅運輸進入線粒體，在線粒體膜間隙中再將銅傳遞給細胞色素c氧化酶 (Maxfield等 ,2004)。 然而，Bertinato 和Abbe(2004) 卻認為，COX17 只是將銅轉運給線粒體，由SCO1和SCO2蛋白負責將銅結合到細胞色素c氧化 酶分子上。細胞色素c氧化酶中的銅 對于能量的有效利用的作用不可低 估，它在細胞中產生ATP的效率最高。
　　

     11 CCS
　　超氧化物歧化酶 (SOD) 是細胞質中一種主要的酶，需要銅和鋅才能發(fā)揮正常功能，其中銅的轉運依賴于銅轉運蛋白 (CCS)。SOD 是胞質中一種必需的抗氧化物酶，對于降解超氧化物自由基非常重要，但在真核生物線粒體的膜間隙也發(fā)現(xiàn)大約1% ～ 2% 的 SOD(Field 等 ,2002)。CCS 蛋白將 apo-SOD 前體轉換為活性 holo-SOD，并對銅濃度變化敏感。 我們最近發(fā)現(xiàn)豬 CCS 中的銅是一種 有機形式的銅，Bertinato 等 (2003)建議 70-kDA 的蛋白可以用作評估 銅含量的生物標記，因為他們發(fā)現(xiàn)， 在缺銅大鼠肝臟和紅細胞中 CCS 的表達呈現(xiàn)出一種劑量依賴性的增量調節(jié)作用。這與肝臟、紅細胞和大腦中 的 SOD 活性不同，雖然標準日糧、 適當缺乏或缺銅日糧會引起機體銅含 量變化，但各組 SOD 活性卻并沒有 差異。而 Bertinato 和 Abbé(2003)報道，銅通過降解 26S 蛋白亞基調節(jié) 培養(yǎng)細胞 CCS 的表達。這可能是當 機體銅缺乏時，哺乳動物保護重要細 胞的一種方式，比如心細胞。
　　我們已經認識到高鋅或藥理濃度鋅日糧會對動物體銅含量造成一定的 影響。1983 年，我們就報道了給妊 娠和泌乳母豬飼喂含鋅量 5,000mg/ kg(ZnO) 的日糧，引起新生仔豬銅缺 乏 (Hill 等 ,1983)。在肝豆核變性病 患者中，我們也發(fā)現(xiàn)這種影響胃腸道 銅吸收的代謝交互效應。飼喂藥理 濃度的鋅引起腸道內 Mt 含量增加，Mt 與腸道內的含銅黏膜細胞結合，導致其脫落，加劇了銅的缺乏 (Hill和 Spears,2000)。如果在動物活體組 織中沒有一個適當?shù)姆从炽~狀態(tài)的生物標記，研究人員將很難評估機體銅含量的變化，然而，CCS 似乎解決了這個問題。Iskandar 等 (2005) 報道，CCS 在紅細胞中的表達對輕微的銅缺乏也表現(xiàn)敏感，而血漿銅藍蛋白和血漿銅濃度卻沒有表現(xiàn)出這種效應。在這個研究中，他們發(fā)現(xiàn)日糧鋅含量240mg/kg 組大鼠十二指腸中 Mt1、ZnT1、ZnT2 和 ZnT4 濃度顯著高于30、60、或 120mg/kg 鋅組。正如預期，30mg/kg 和 60mg/kg 鋅組十二指腸Zip4 含量高于 120mg/kg 和 240mg/ kg 組。因此，這些鋅銅載體對我們 研究藥理濃度的鋅、銅或兩者聯(lián)合使 用的生物學機制是非常有用的。
　　

      12Atox1
　　另一個銅伴侶蛋白Atox1通過與ATP7A(轉銅ATPase1)和ATP7B( 轉銅 ATPase2) 的直接交互 作用，將銅轉移給他們。這兩個蛋白 與 P 型 ATPase 密切相關，他們通 常在轉運高爾基體網將銅轉移給賴氨 酸氧化酶、血漿銅藍蛋白等含銅酶(Cater 和 Mercer,2005)。如果細胞內銅濃度增加，ATP7A 將多余銅釋放 到質膜內側，而ATP7B 將其儲存在 質膜囊泡內。因此，除了將銅轉移合成必需的含銅酶以外，這些 ATPase還作為一種解毒途徑，幫助細胞清除 或存儲多余的銅。肝臟是調節(jié)銅平衡 的主要器官，它是體內銅的儲存庫，它以血漿銅藍蛋白形式將銅分泌入血漿或以一種不能重吸收的形式分泌入膽汁，來調節(jié)機體的銅含量。肝豆核 變性患者銅代謝紊亂，主要是由于體內ATP7B 蛋白生成障礙，不能將適量的銅分泌入膽汁所致。門克斯病 患者由于 ATP7A 基因的缺陷，銅的吸收和分配發(fā)生障礙，由于沒有足夠的 ATP7A 來進行銅跨血腦屏障的轉運，導致大腦缺銅。因此，Atox1是銅從 Ctr1 運輸?shù)?ATPase(ATP7A和 ATP7B) 的 第 1 個 連 接， 通 過ATPase 最后將銅轉移給許多含銅酶類 (Cater 和 Mercer,2005)。
　　

    13 其他銅鋅蛋白
　　其他蛋白也會影響動物對銅的需要或者防范單體或離子銅的風險。伯靈頓更患者含有一種常染色體隱性 遺傳基因 (MURR1 或 COMMD1)，已證實這種基因與 ATP7B 存在交互 作用 (Bertinato 和 L'Abbé,2004)。在哺乳動物中，ATP7B 蛋白具有多 種功能，但它在銅代謝中的作用尚不 明確，它影響伯靈頓更患者肝臟中銅 的蓄積，作用方式與肝豆核變性病 相似。盡管 Mt 在種屬和進化時期上 存在廣泛的同源性，但是這種高硫 含量的低分子蛋白的主要功能至今 尚不明確?？梢钥隙ǖ氖牵墓?能之一就是沉積過量的銅、鋅等陽 離子，最終作為一種降低這些陽離 子毒性的生物學手段。而 Mt 的功能 可能不僅僅是防止過量的銅、鋅吸 收，而且還與這些元素的正確價態(tài) 或靶向吸收有關。
　　

14 結論
　　隨著飼料成本的增加，人們越 來越關注產品質量以及如何減少動物 排泄物中礦物對環(huán)境的污染。如何根 據家畜種屬、遺傳基礎、生理階段以 及環(huán)境四個方面，確定家畜日糧銅、鋅和其他微量元素的適宜添加水平，已成為我們的挑戰(zhàn)。而分子生物學技術的應用，是我們現(xiàn)在以及將來獲得 這些信息的有效工具。（參考文獻略。文章來源：吉隆達集團技術中心　作者：楊 帆 羅仕偉 文 然）


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