酵母水解物中甘露聚糖的檢測(cè)

畜牧人市場(chǎng)部2

      酵母生物技術(shù)和碳水化合物化學(xué)的研究進(jìn)展為解決霉菌毒素問題提供了新方法。研究發(fā)現(xiàn), 存在于酵母細(xì)胞外壁的功能型碳水化合物———甘露聚糖對(duì)霉菌毒素有很強(qiáng)的吸附能力。人們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 酵母細(xì)胞能通過吸收毒物和病原菌到細(xì)胞壁上來改善動(dòng)物健康。根據(jù)這一研究, 甘露聚糖成為新型霉菌毒素吸附劑研究的重點(diǎn), 被認(rèn)為是具有很大開發(fā)價(jià)值的天然綠色添加劑。

　　酵母甘露聚糖逐漸被各個(gè)飼料企業(yè)及配方專家們所肯定及應(yīng)用，但如何選擇優(yōu)質(zhì)的酵母甘露聚糖產(chǎn)品？如何測(cè)定甘露聚糖含量？

　　酵母甘露聚糖的含量

　　甘露聚糖是一種有分支的聚合物，主鏈以α-1,6糖苷鍵結(jié)合，支鏈以α-1,2或α-1,3糖苷鍵結(jié)合，約占酵母細(xì)胞壁干重的30%。

　　針對(duì)目前市場(chǎng)上的酵母甘露聚糖產(chǎn)品，我們推薦酵母水解物中甘露聚糖的含量應(yīng)≥10%；

　　酵母細(xì)胞壁中甘露聚糖的含量應(yīng)≥20%，總多糖≥45%。

　　酵母甘露聚糖的檢測(cè)

　　1.原理

　　基于甘露糖在流動(dòng)相和液相色譜柱的固定相之間具有不同的分配系數(shù)，將水解后的樣品注入液相色譜，用純水做流動(dòng)相，糖類分子流出后，經(jīng)示差檢測(cè)器檢測(cè)，用外標(biāo)法定量。

　　在甘露聚糖水解時(shí)，由于樣品可能存在水解不徹底，以及水解產(chǎn)生的葡萄糖和甘露聚糖由于其他高溫造成部分發(fā)生其他副反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果比產(chǎn)品中實(shí)際含量偏低。檢測(cè)中采用葡聚糖對(duì)上述水解過程引起的誤差進(jìn)行修正。

　　2.儀器

　　1) 水浴鍋；
　　2) 旋渦混合器；
　　3) 電爐；
　　4) 壓力蒸汽滅菌器；
　　5) 高效液相色譜儀：帶示差檢測(cè)器和糖柱（6.5 mm×300 mm，waters sugar pak-1）。

　　3.試劑

　　1) 純水；
　　2) 鹽酸：37%左右；
　　3) 甘露糖：標(biāo)準(zhǔn)品；
　　4) 氫氧化鈉：AR；
　　5) 甘露糖標(biāo)液（2 g/L）：稱取甘露糖0.2000 g，用純水定容至100 ml。
　　6) 葡聚糖對(duì)照品（curdlan from Alcaligenes faecalis）: Sigma產(chǎn)品，貨號(hào)C7821。
　　7) 氫氧化鈉溶液：300 g/L。

　　4.操作步驟

　　4.1樣品處理

　　準(zhǔn)確稱取400 mg(精確至0.1 mg)樣品放入一個(gè)20 ml的耐熱玻璃制的帶螺帽的小試管中，加入6.0 ml鹽酸（37%），小心的將小瓶蓋緊后用漩渦混合器混合，得到均一的懸浮液。將小瓶放入30 ℃水浴中處理45 min，每15 min用漩渦混合器震蕩混合一次。然后將懸浮物定量的轉(zhuǎn)移到200 ml杜氏瓶中，用約100~200 ml的水，分幾次洗滌小試管，洗滌液并入杜氏瓶中。將杜氏瓶放入高壓滅菌鍋，121 ℃下處理60 min.取出后冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)將溶液調(diào)PH到6~7，然后定容至200 ml。使用0.45 μm孔徑的醋酸纖維素膜過濾備用。

　　同時(shí)準(zhǔn)確稱取葡萄糖對(duì)照品200 mg，按樣品處理方法進(jìn)行同樣的處理。

　　4.2 色譜條件

　　采用純水作為流動(dòng)相，流速為0.5 ml/min，柱溫80℃，待儀器基線平穩(wěn)后再進(jìn)樣。

　　4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　分別吸取甘露糖標(biāo)液1、2、3、4、5 ml到10 ml容量瓶中，用高純水定容到刻度，得到甘露糖為200、400、600、800、1000 mg/L的標(biāo)樣。在上述色譜條件下準(zhǔn)確進(jìn)樣20 μl，得到色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度之間的回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　4.4樣品及對(duì)照品的測(cè)定

　　在同樣的色譜條件下，將處理好的樣品和葡聚糖對(duì)照品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。用糖標(biāo)樣色譜峰的保留時(shí)間定性，用糖標(biāo)樣色譜峰的峰面積來定量。

　　5.計(jì)算結(jié)果

　　甘露聚糖的含量按下式計(jì)算：

  式中：



　　式中：

　　X—樣品中甘露聚糖的含量，%；
　　A1—根據(jù)樣品溶液的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品溶液的甘露糖的含量，mg/L；
　　A2—根據(jù)葡聚糖對(duì)照品溶液的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品溶液的葡萄糖的含量，mg/L;
　　m1-—稱取樣品的質(zhì)量，g;
　　m2—稱取葡聚糖對(duì)照品的質(zhì)量，g;
　　0.2—樣品/葡聚糖對(duì)照品處理后定容的體積，L；
　　0.9—將甘露糖換算成甘露聚糖的系數(shù)；
　　F—樣品酸水解中葡萄糖和甘露糖被破壞造成結(jié)果偏低的經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)償系數(shù)；
　　P—葡聚糖對(duì)照品的純度（依據(jù)試劑廠家提供的檢驗(yàn)報(bào)告）；
　　W—葡聚糖對(duì)照品的水分（依據(jù)試劑廠家提供的檢驗(yàn)報(bào)告）；
　　備注：在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，一般1~2個(gè)月檢測(cè)F值即可。F值在1.25左右，實(shí)驗(yàn)室定期對(duì)F值進(jìn)行修正。

　　6.誤差分析

　　在重復(fù)性檢測(cè)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差不得超過下表中所規(guī)定的數(shù)值：

來源：海宜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)公眾微信號(hào)